《酶組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)》習(xí)題1

1、酶組織化學(xué)與免疫組織化學(xué)技術(shù)習(xí)題第一部分組織學(xué)技術(shù)和免疫組織化學(xué)技術(shù)一、選擇題 （一）A1型題(標(biāo)準(zhǔn)型) 1.C 2.B 3.A 4.C 5.A 8.B 9.C 10.D 14.A 23.D1.免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵步驟是 A.標(biāo)本處理 B.抗體的處理與保存 C.免疫染色D.設(shè)立對照試驗 E.結(jié)果判斷2.免疫組化技術(shù)的首要試劑是 A.抗原 B.抗體 C.標(biāo)記物D.固定劑 E.洗滌液3.酶免疫組化技術(shù)中，關(guān)于標(biāo)本處理的說法正確的是 A.充分洗后于室溫用0.3%H2O2和80%甲醇處理2030min。B.充分洗后于室溫用0.3%H2O2和80%甲醇處理4050min。C.充分洗后于室溫用0.5%H2O

2、2和90%甲醇處理2030min。D.充分洗后于4用0.3%H2O2和80%甲醇處理2030min。E.充分洗后于4用0.3%H2O2和80%甲醇處理4050min。4.PAP法是Sterberger等于哪一年建立的 A.1950B.1960C.1970D.1980E.19905.PAP復(fù)合物中的酶是 A.辣根過氧化物酶B.堿性磷酸酶C.葡萄糖氧化酶D.胃蛋白酶E.膠原酶8.PAP法中的“橋”是 A.第一抗體B. 第二抗體C. 第三抗體D.親和素E.第四抗體9.ABC技術(shù)由美籍華人Hsu于哪一年建立，已廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢測技術(shù) A.1961B.1975C.1981D.1985E.199010.

3、ABC法中的“橋”是指 A.第一抗體B. 第二抗體C. 第三抗體D.親和素E.鏈霉素親和素14.免疫組化法吸收試驗是用過量已知抗原與抗體在多少度以下充分反應(yīng)，離心后再行免疫組化染色 A.4B.20C.40D.37E.5023PAS反應(yīng)是檢測組織內(nèi)的：A.核酸 B.脂C.蛋白質(zhì)D.多糖E.抗原一、填空1、免疫組織化學(xué)中最常用的標(biāo)記物是_熒光素_、_酶_ 、_生物素和親和素_、_。原位雜交組織化學(xué)中常用的標(biāo)記物有_和_兩大類。2、 常用的粘附劑有_、_ 、_等。3、抗原決定簇是指_分子表面的、具有活性的_。4、一般組織化學(xué)是利用化學(xué)或物理反應(yīng)，在組織標(biāo)本上加入一定的_，使其發(fā)生反應(yīng)，形成_，能在顯

4、微鏡下觀察。常用于檢測_、_ 、_等。5、酶組織化學(xué)是利用酶對其_的催化作用 ，生成_，再與某種_反應(yīng)，形成_沉淀，檢測_分布及活性的方法。常用的方法有_ 、_、_、_和_。6、最常用于顯示細(xì)胞、組織內(nèi)的多糖和蛋白多糖的方法是 過碘酸-雪夫反應(yīng)PAS。7.、免疫染色對特殊標(biāo)本的進(jìn)一步處理常用 _和_法。8、免疫組化中最常用的制片方法是_和_。9、免疫組化染色后，陽性細(xì)胞的染色分布有三種類型，分別是_、_和_。10、酶免疫組化技術(shù)中最常用的酶有_、_及_。11、免疫電鏡標(biāo)本的制備主要有_、_和_三種。 12、組織塊包埋前需先經(jīng)_，常用的包埋劑是_、_和_。13、光學(xué)顯微鏡下觀察的固定標(biāo)本除組織切

5、片外，還有_、_和_。14、免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)中常用的標(biāo)記物有_、_、_和_。填空 1、熒光素、酶、生物素和親和素、鐵蛋白和膠體金。放射性同位素、非同位素標(biāo)記物（非放射性同位素）。2、蛋白甘油、甲醛明膠、多聚賴氨酸。3、抗原、特異性化學(xué)集團(tuán)。4、化學(xué)試劑，有色沉淀物，糖類、脂類、核酸、酶。5、底物，初反應(yīng)產(chǎn)物，捕捉劑，有色終反應(yīng)物沉淀，酶。金屬沉淀法、偶氮偶聯(lián)法、四唑鹽法、靛藍(lán)法、DAB法（聯(lián)苯胺法）。6、PAS反應(yīng)（過碘酸希夫反應(yīng)）。 7、蛋白酶消化法，非特異吸附法8、冰凍切片，石蠟切片 9、胞質(zhì)型 細(xì)胞核型，細(xì)胞膜表面型 10辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶 葡萄糖氧化酶 11、非包埋法免疫染色，包

6、埋前免疫染色，包埋后免疫染色12、固定，石蠟，火棉膠，樹脂13、涂片，鋪片，磨片14、熒光素，酶，鐵蛋白，膠體金二、名詞解釋1.HE染色法2、固定：在保持組織形態(tài)完好和被檢測抗原的前提下，應(yīng)采用濃度最低的固定劑和最短的固定時間，固定時間一般為1-12小時，常用的的固定液有醛類固定劑、丙酮及醇類固定劑以及其他固定劑。2.銀染法3.冷凍切片4.組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)術(shù)5.免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)6.原位雜交7.膠體金8.簡述石蠟切片的制備過程。9、背景著色 10、一抗和二抗11、探針12、免疫組織化學(xué)技術(shù)1、HE染色法是一種最基本的組織切片染色方法，廣泛應(yīng)用于教學(xué)和科研中。染色液是由蘇木精（hematoxyli

7、n，堿性染料）和伊紅（eosin，酸性染料）配制而成，蘇木精使細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的嗜堿性物質(zhì)著紫藍(lán)色，伊紅使細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)和間質(zhì)內(nèi)的膠原纖維等著紅色，染色鮮艷，觀察方便。2、銀染法是用硝酸銀配制的溶液浸染組織切片或細(xì)胞的染色方法。有些結(jié)構(gòu)可直接使硝酸銀還原，銀粒附著在結(jié)構(gòu)上而顯色，稱此為親銀性；有些結(jié)構(gòu)無直接還原作用，需加入還原劑才能使銀粒附著在結(jié)構(gòu)上，稱此為嗜銀性。有些結(jié)構(gòu)和細(xì)胞可以這種銀染法而顯示，如網(wǎng)狀纖維（又稱嗜銀纖維），神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的神經(jīng)原纖維、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的某些成分，以及一些神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞內(nèi)的分泌顆粒等。用銀染法顯示的細(xì)胞，有的可稱為嗜銀細(xì)胞。3.冷凍切片是新鮮組織或固定組織在低溫下快速

8、冷凍后制備組織切片的方法。一般是將組織塊置入干冰或液氮內(nèi)使其快速凍結(jié)，然后在恒冷箱切片機(jī)內(nèi)制冷凍切片。這種方法制片快速，常用于外科手術(shù)切除標(biāo)本的快速病理診斷。由于這種制片方法可免去組織塊包埋等程序，細(xì)胞和組織內(nèi)的一些成分如糖原、酶等保存較好，故較適用于組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色研究。4.組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)術(shù)是應(yīng)用化學(xué)或物理反應(yīng)原理顯示組織切片或細(xì)胞內(nèi)某種化學(xué)成分，進(jìn)行定位、定量及其與功能相關(guān)研究的方法。方法種類甚多，顯色反應(yīng)的原理也各不相同，分別用于顯示組織或細(xì)胞內(nèi)的多糖類、脂類、各種酶及核酸等成分。一些經(jīng)典的染色方法如PAS反應(yīng)顯示組織內(nèi)的多糖和蛋白多糖等，F(xiàn)eulgen反應(yīng)顯示細(xì)胞核內(nèi)的DNA

9、，用Sudan等染料顯示脂肪細(xì)胞，以及顯示細(xì)胞內(nèi)酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、ATP酶、琥珀酸脫氫酶、過氧化物酶等的方法。 5.免疫細(xì)胞化學(xué)術(shù)是應(yīng)用免疫學(xué)原理，通過特異性標(biāo)記抗體與抗原（某種蛋白質(zhì)、多肽等）的結(jié)合來顯示細(xì)胞內(nèi)某種抗原，并進(jìn)行定位和定量的研究方法。這種方法特異性強(qiáng)，敏感性高，進(jìn)展迅速，應(yīng)用廣泛，已成為當(dāng)今生命科學(xué)諸多學(xué)科及臨床醫(yī)學(xué)檢驗普遍應(yīng)用的重要手段。機(jī)體組織內(nèi)的蛋白質(zhì)種類繁多，多種蛋白質(zhì)和多肽已被提純并制成其抗體，目前有多種標(biāo)記二抗（酶標(biāo)記、熒光素標(biāo)記、膠體金標(biāo)記等）商品供應(yīng)，使免疫細(xì)胞化學(xué)的操作更簡便，應(yīng)用更普遍。6.原位雜交術(shù)是在免疫細(xì)胞化學(xué)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種核酸分子雜交技

10、術(shù)，用來檢測細(xì)胞內(nèi)某種蛋白質(zhì)的基因（DNA片段或mRNA片段）表達(dá)和定位與定量研究，目前已成為細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)研究的重要手段。其基本原理是應(yīng)用已知的并被標(biāo)記的核酸片段（同位素或熒光素、酶等標(biāo)記的探針）與細(xì)胞內(nèi)待測核酸（RNA或DNA片段）進(jìn)行雜交，在光鏡和電鏡下觀察目的mRNA或DNA的存在與定位。 7.膠體金.膠體金是氯金酸在還原劑如白磷、維生素C枸櫞酸納和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱為膠體金。8.石蠟切片制備程序：取材與固定；脫水、透明與包埋；切片與染色；封固。1、背景著色 2、一抗和二抗 3、探針 4、免疫組織化學(xué)技術(shù) 答案： 名

11、詞解釋：1、是指免疫組化過程中產(chǎn)生的非檢測抗原（或抗體）的著色，又稱非特異性著色，往往造成假陽性?？筛蓴_顯色結(jié)果的判斷，因此染色時，應(yīng)盡量減小或消除背景著色。 2、第一抗體，簡稱一抗（Ab1）：是針對待測抗原的抗體。第二抗體，簡稱二抗(Ab2)：是用一抗作為抗原免疫另一種動物制備的抗體3、探針是指已知堿基序列的、用標(biāo)記物標(biāo)記了的一段核苷酸片斷，用來檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的某一特定DNA片段或RNA片段。 4、是應(yīng)用抗原、抗體間特異性免疫反應(yīng)的原理,用標(biāo)記物標(biāo)記的已知抗體（或抗原）檢測組織細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、多肽等相應(yīng)的抗原（或抗體）的方法。三、簡答題1.免疫組織化學(xué)的全過程包括哪些步驟？答： 1）抗原的

12、提取與純化 2）免疫動物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體及純化 3）標(biāo)記物與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體 4）標(biāo)本的處理 5）抗原抗體反應(yīng)和呈色反應(yīng) 6）顯微鏡下觀察結(jié)果2.免疫組化標(biāo)本固定時，好的固定劑應(yīng)滿足哪些要求？答：1）能快速固定抗原 2）防止抗原物質(zhì)擴(kuò)散3）固定后的抗原能被抗體識別，不影響抗原抗體反應(yīng)。3.簡述熒光免疫組化技術(shù)直接法的原理。答：將熒光素標(biāo)記的已知抗體（或抗原）與切片（印片）中相應(yīng)抗原（或抗體）直接發(fā)生反應(yīng)，以檢測組織與細(xì)胞標(biāo)本中的靶抗原（或抗體）。4.何謂免疫電鏡技術(shù)？答：免疫電鏡技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)的特異性與電子顯微鏡的高分辨力相結(jié)合的在亞細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)水平上對抗原進(jìn)行定位分析的

13、一種高度精確、靈敏的技術(shù)。四、論述題1.試述酶免疫組化技術(shù)的原理及其應(yīng)用。2. 試述任意3種酶組織化學(xué)技術(shù)的反應(yīng)原理。3. 試述免疫熒光雙標(biāo)記技術(shù)（間接法）的原理和當(dāng)兩種一抗及兩種二抗分別混合使用時應(yīng)注意的問題。 4. 試述免疫組織化學(xué)ABC技術(shù)中，組織抗原、一抗、二抗和ABC如何依次相互結(jié)合的。 1、酶免疫組化技術(shù)的原理： 酶免疫組化技術(shù)是利用酶標(biāo)記已知抗體（或抗原），然后與組織標(biāo)本中相應(yīng)抗原（或抗、1體）在一定條件下相互結(jié)合形成帶酶分子的復(fù)合物，酶遇到底物時，能催化底物水解，或氧化或還原，產(chǎn)生有色的不溶性產(chǎn)物，出現(xiàn)顯色反應(yīng)，在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞與組織表面或內(nèi)部某種抗原成分的定位觀察分析。 酶

14、免疫組化技術(shù)的特點：敏感性較免疫熒光技術(shù)更高，可用普通光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察結(jié)果，便于對組織細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)的分辯，染色標(biāo)本可長期保存。 應(yīng)用：惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；對某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型；軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時難以區(qū)分其組織來源，應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。為臨床提供治療方案的選擇。2、酸性磷酸酶反應(yīng)原理：鉛法和重氮偶聯(lián)法 1.鉛法：在PH為5.0的條件下，酸性磷酸酶（ACP）水解其底物：-甘油酸鈉，產(chǎn)生P

15、O43-,后者被捕獲劑Pb(NO3)2的Pb2+直接捕獲形成無色的Pb3 (PO4)2沉淀，后者又與(NH4)2S發(fā)生置換反應(yīng)，最終形成棕黑色沉淀。 2.重氮偶聯(lián)法：-苯酚磷酸鈉或萘酚AS-BI磷酸被酶水解放出萘酚，后者立即被重氮鹽捕獲偶聯(lián)而生成有色偶氮色素沉淀（紅色）。 乙酰膽堿酯酶反應(yīng)原理： 亞鐵氰化銅法：乙酰膽堿酯酶（AChE）能將乙酰膽堿鹽水解產(chǎn)生硫膽堿，使鐵氰化物還原為亞鐵氰化物，后者與銅離子結(jié)合成亞鐵氰化銅而呈現(xiàn)有色沉淀(棕色)。 NO合酶反應(yīng)原理： NADPH-d法：一氧化氮合酶可催化前體物質(zhì)L-精氨酸轉(zhuǎn)變成為L-瓜氨酸和NO，由于NOS和NADPH-d可能為同一種酶，并且都可以

16、還原輔酶（NADPH）為輔助因子，介導(dǎo)NOS催化L-精氨酸轉(zhuǎn)變成為L-瓜氨酸和NO，并釋放電子，后者又被NADPH傳遞給硝基四唑蘭（N-BT）, N-BT可被還原為有色沉淀（藍(lán)色）。3、基本原理：將兩種抗體分別用不同的熒光色素加以標(biāo)記，用來定位同一細(xì)胞內(nèi)存在兩種不同成分，以便根據(jù)兩種成分的定位試圖說明該細(xì)胞的生物功能。 注意的問題：抗兩種一抗同時加入，二抗甲先加入，二抗乙后加入。1、整個程序均在室溫下，濕盒內(nèi)進(jìn)行。 2、一抗和二抗均用PBS稀釋，一抗的濃度要比PAP法中高得多，越位后者的5倍 。3、甘油封片后須立即鏡檢或置于4冰箱中待檢 。4、實驗中若想兩步完成四步實驗程序，應(yīng)注意：a.抗甲抗原抗體和抗乙抗原抗體非同種抗體（如鼠抗和兔抗），且不能相互競爭受體。b.兩種二抗必須與一抗相對應(yīng)（如鼠抗對應(yīng)兔抗）。4、ABC法是在LAB法和BAB法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，此法需要兩種抗體，即第一抗體和第二抗