酶促反應動力學實驗_第1頁
酶促反應動力學實驗_第2頁
酶促反應動力學實驗_第3頁
已閱讀5頁,還剩13頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領

文檔簡介

1、酶動力學綜合實驗實驗一一一堿性磷酸酶值的測定【目的要求】1. 了解底物濃度對酶促反響速度的影響2. 了解米氏方程、值的物理意義及雙倒數(shù)作圖求值的方法?!緦嶒炘怼?、堿性磷酸酶:堿性磷酸酶是廣泛分布于人體各臟器器官中,其屮以肝臟為最多。其次為腎臟、骨骼、腸和胎盤等組織。但它不是單一的酶,而是一組同功酶。本實驗用的堿性磷酸酶是從大腸桿菌屮提取的。2、米氏方程:在研究底物濃度與酶促反響速度的定量關系時,導出了酶促反響動力學的根本公式,即:V二卩機0卅S1K池十式屮:V表示酶促反響速度,也丈表示酶促反響最大速度,S表示底物濃度,心表示米氏常數(shù)。3、心值的測定主要采用圖解法,有以下四種: 雙曲線作圖法

2、圖 1-1, a根據(jù)公式1,以v對s作圖,此時1/2$人時的底物濃度s值即 為值,以克分子濃度W表示。這種方法實際上很少采用,因為在實驗條 件下的底物濃度很難使酶到達飽和。實測是一個近似值,因而1/21A不準確。此外由于v對S的關系呈雙曲線,實驗數(shù)據(jù)要求較多,且不易 繪制。 作圖法雙倒數(shù)作圖法圖 1-1, b實際工作屮,常將米氏方程式 1作數(shù)學變換,使之成為直 線形 式,測定要方便、準確得多。其中之一即取 1 式的倒數(shù) , 變換為方程 式:丄=旦* 丄+亠v Vmax S Vmax2以決堆 1 作圖,即為形式。此時斜率為怦,縱截距為產(chǎn)。把直線 U U VE*VEX外推與橫軸相交,其截距相交,其

3、截距即為一亡。 作圖法略把2式等號兩邊乘以Vmax,得:輕 V+1Km*max3)以V對著作圖,這時斜率為-心,縱截距嘰,橫截距為-獸AJ作圖法(略)把(2)式等號兩邊乘以S以旦對s作圖,這時斜率為宀,縱截距為嚴。I? V mar(b)本實驗主要以雙倒數(shù)法,即作圖法來測定堿性磷酸酶值。具體原理如下:本實驗以堿性磷酸酶為例,用磷酸苯二鈉為其作用物, 堿性磷酸 酶能分解 磷酸苯二鈉產(chǎn)生酚和磷酸,在適宜條件下(10.0,和60°C),準確反響13分 鐘。在堿性條件下酚可與酚試劑生成藍色 化合物,以波長620比色。在 一定條件下色澤深淺與光密度成正 比。反響式如下:9OH 霸試劑磷孵酸藍色化

4、合物然后以光密度直接表示不同底物濃度時的酶反響速度, 即以光密度的倒數(shù) 作縱坐標,以底物濃度的倒數(shù)作橫坐標,按作圖法來 測定堿性磷酸酶值。【儀器與試劑】儀器:1 ?恒溫水浴2. 721型分光光度計試劑:1. 酚試劑:稱鶴酸鈉"亦血吃禺。100g,鉗酸鈉血血吃弘。25g置1500磨口回流裝置內(nèi),加蒸憎水 700, 85%磷酸50和 濃硫酸100。 充分混勻,使其溶解。小火加熱,回流10h 燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)顆, 以防溶液溢出,再參加硫酸鋰 4150g,蒸館水50及液澳數(shù)滴。在通風櫥中開口煮沸 15,以除 去多余的 澳。冷卻后定容至1000,過濾即成,此液應為鮮黃 色,不帶任何綠色。 置

5、棕瓶中,可在冰箱長期保存。假設此 貯存液使用過久,顏色由黃變綠,可加幾滴液漠,煮沸幾分 鐘,恢復原色仍可繼續(xù)使用。使用時用 蒸憎水稀釋一倍,最 后酸度為INO2. 2. 5磷酸苯二鈉基質(zhì)液:稱取625磷酸苯二鈉C6H542? 2H20,溶于1,000容量瓶屮,加蒸餡水稀釋至刻度,加數(shù)滴夜漠以防腐,置冰箱內(nèi)可保存一年之久。3.3. 堿性磷酸酶液:稱取堿性磷酸酶1加水3、4,冰箱內(nèi)可保存 五周左右?!緦嶒灢襟E】取6支試管按下表參加試劑1234562.5磷酸苯二鈉00.20.40.60.81.01.0蒸憾水00.80.60.40.2-0堿性緩沖液01.01.01.01.01.01.0混勻后,60&#

6、176; C欲溫5分鐘堿性磷酸酶液0.10.100.10-混勻后,60 C水浴1注意:1參加堿性磷酸 酶沼2此時為酶促犬3第六管3分鐘帥 要快速、 乏響,總體 "不加酶。亍確計時隹確。用移液槍加積2酚試劑01.01.01.01.01.01.01023()3.03.03.03.03.03.0混勻后,室濫 注意:1酚試劑為顯色劑,|5 劑后酶促反223提供堿性環(huán)境,丄放置15分鐘時為酶的變性劑,故參加酚試響即停頓。參加23后試劑才顯色以6管為調(diào)零點,在620波長處比色【結(jié)果處理】1將各管光密度和底物濃度記入下表管號1SI1/S123452以1為縱坐標,l/s為橫坐標,按作圖,求出堿性磷酸

7、酶的值【本卷須知】1) 參加堿性磷酸酶的量要準確2) 保溫時間要準確準確保溫的方法:從第一管參加酶液開場計時,每隔 1 分鐘向 下一只試 管加酶液,直至加完,到準確 13 分鐘立即向第一管加酚 試劑,以終止其 反響,并每隔 1 分鐘向下一只試管加酚試劑,直 至加完止,這樣保證每 管準確保溫 13 分鐘?!舅伎碱}】1) 的意義及其影響因子2) 為什么酶促反響速度以初速度表示3) 為什么可直接代替 V 作圖4) 分析自己的實驗數(shù)據(jù)實驗(二)一一溫度對酶活性的影響【實驗目的】了解溫度對酶活性及酶促反響速度的影響,加深對酶特性的認【實驗原理】i般而每種酶都有其最適溫度,高于或低于此溫度酶的活性都降低。

8、言,假設酶處于過高的溫度環(huán)境中,會使酶活性永久喪失 ;而假設處于極低溫度的環(huán)境屮只會使酶活性受到抑制,一旦溫度,酶又會全部或局部的恢復其活性?!緝x器與試劑】儀器:1.冰箱管和試管架4.吸量管及吸量管架頭滴管7燒杯試劑:2.恒溫水浴鍋5.移液槍及槍頭3試6.膠3. 0. 03175 碘液5. 1M溶液6.稀釋100倍4. 1M溶液的唾液7.冰水浴【實驗步驟】1. 制管和預溫由于本實驗對恒溫反響要求較高,故每個溫度梯度使用兩支 試管,分別標記為A管和B管,同時欲溫底物與酶取12支干凈試管,參照下表參加試劑:7/157 / 15管號1 (0 °)2 室溫3(37 ° C)4(50

9、9)5(70 °C)6 室溫A6.8的緩沖 液222222含的0. 5%淀粉液22222用2的蒸 憾水代替B稀釋100倍的唾液111111*6號管為對照組比色時作為 0號管,置于室溫,且淀粉液用蒸憎水代替2. 混合A、B管將1號A管試劑迅速參加溫度對應的 B管中為了最大限度 保證 酶的量,此時為計時的起點使用秒表,搖勻后放回對應 溫度繼續(xù) 水浴。注意:轉(zhuǎn)移A管試劑前需將其搖勻。3. 時間控制然后每隔1或2時間自定按上步操作依次把 2、3、4、5、6號的A、B管混合,嚴格控制好時間。4. 中止反響準確反響13,向1號管參加2滴1M溶液,立即混勻,屮止 反響, 按上一步的順序和時間間隔依

10、次對各管進展操作,并移至 試管架。后再 各用2滴1M溶液屮和每管。5. 顯色在每管中各參加2 0.03175碘液并混勻,觀察現(xiàn)象6. 比色假設不同溫度梯度間現(xiàn)象差異不明顯,那么進展比色,通過光密度值來比較?!窘Y(jié)果處理】 記錄現(xiàn)象或比較吸光度值,做出合理分析?!颈揪眄氈繃栏褡⒁鈺r間的控制及各物質(zhì)的添加量。【思考題】 如果某同學沒有嚴格按照教案步驟做出的實驗結(jié)果為唾液淀 粉酶的 最適溫度為 70 度,請分析他得出這樣的結(jié)果的可能原因。實驗三對酶活性的影響【實驗目的】 了解對酶活性及酶促反響速度的影響,加深對酶特性的認識?!緦嶒炘怼? 對酶活性影響的機理:影響酶活性中心的某些必須基團的解離,而這

11、些基團往往僅在某一解離狀態(tài)時才最容易同底物結(jié)合或 具有最大催化 活性;影響可解離基團的底物和輔酶的荷電狀態(tài), 從而影響酶對他們的 親和力;還可以影響酶活性屮心的空間構(gòu)象 , 從而影響酶的活性。2. 本實驗用唾液淀粉酶為材料來觀察酶活性受的影響的情況。 淀粉 在該酶的催化作用下會隨著時間的延長而出現(xiàn)不同程度的 水解,從而得 到各種糊精乃至麥芽糖,少量葡萄糖等水解產(chǎn)物。碘 液與淀粉及其不同 程度的水解產(chǎn)物反響呈現(xiàn)不同顏色,即淀粉9 / 159 / 15 藍色、紫色糊精紫色、紅色糊精紅色、麥芽糖及少量葡萄 糖 黃色?!緝x器與試劑】儀器:1、冰箱2、電爐3、恒溫水浴鍋4、試管架及試管5、移液管架及移液

12、管試劑:1、 0. 2M磷酸氫二鈉溶液:稱取35. 61g含2個結(jié)晶水的磷酸 氫二 鈉,用水定容至 1L。2、 0. 1M檸檬酸溶液:稱取21.01g含一個結(jié)晶水的檸檬酸,用水定 容至 lLo3、唾液淀粉酶:將唾液分別稀釋 10 倍、 50 倍和 100 倍,得 三種不 同濃度的酶液、5、0.1%淀粉液:0. lg可溶性淀粉,加到100蒸憾水中,加 熱溶解。6、碘液: 15g 碘化鉀和 12. 7g 碘,加少許水使碘完全溶解后 , 再用水稀釋至 200。7、1%氯化鈉溶液。8、0. 1%硫酸銅溶液?!緦嶒灢襟E】一對酶活性的影響表1磷酸1編號和加試劑:2操作:1、緩沖溶液的配制配制取六只干凈的三

13、角燒瓶,按表 取六支干凈試管,編號后按表三角燒瓶號123456值5.46.26.87.07.48.00.2M磷酸二氫鈉 011.1513.2215.4516.4718.1719.450.1 M檸檬酸08.856.784.553.531.830.55表2對酶活性的影響管號123456值5.46.26.87.07.48.0緩沖液量333333含的0.5%淀粉0222222稀釋100倍唾液0222222充分搖勻,37° C水浴保溫,嚴格控制時間5后,立即向各管參加碘液碘液滴333333充分搖勻,觀察各管顏色差異【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象或比較吸光度值,做出合理分析【本卷須知】 充分搖勻,嚴格控制

14、時間思考題】酶的最適值受哪些因素影響 ?實驗四一一酶濃度對酶活性的影響的認識。速度隨而且酶的同一適【實驗目的】 了解酶濃度對酶活性及酶促反響速度的影響,加深對酶特性【實驗原理】在適宜的條件下,假設反響物濃度大大高于酶濃度時,反響 酶濃度增加而增加,兩者間成正比。但假設反響底物濃度 較低 濃度足夠高時,增加酶濃度,反響速度根本不變。本實驗采用唾液淀粉酶為例。參加不同濃度的酶,并比較在 當時間后,以碘檢驗淀粉的含量從而確認其反響程度?!緝x器與試劑】儀器:1 ? 恒溫水浴鍋2. 吸量管3. 試管與試管架試劑:1. 含的 0.5%淀粉液2.7. 0的緩沖液3.分別稀釋過10倍、50倍和100倍后的唾液

15、【實驗步驟】1.取3支干凈試管,按下表參加淀粉液,緩沖液,加畢放入37度恒溫水浴鍋屮保溫5分鐘;2.保溫后,快速參加不同濃度的稀釋唾液,搖勻,立即放入37度恒溫水浴屮,并計時。約 3至4分鐘后參加等量碘液一至 兩滴,立 即搖勻后,記錄各管的顏色。管號含的0.5%淀粉液7.0的緩沖液稀釋唾液顏色10倍50倍100倍132123213321【結(jié)果處理】記錄現(xiàn)象,做出合理分析【思考題】實驗五離子對酶活性的影響【實驗目的】了解離子對酶活性及酶促反響速度的影響,加深對酶特性的認識【實驗原理】酶的活性常常受某些物質(zhì)的影響,有些物質(zhì)能使酶的活性增 加,稱 為酶的激活劑;有些物質(zhì)能使酶的活性降低,稱為酶的抑 制劑。是唾液淀 粉酶的激活劑。其它的陰離子,女口、和對該酶 也有激活作用,但較微 弱。而貉對唾液淀粉酶具有抑制作用。激 活劑和抑制劑影響酶活性的劑量 是很少的,并且常具有特異性。就本實驗,低濃度可以增加酶活性,高濃度的或者低濃度的 那么會 抑制酶活性,同時低濃度的、產(chǎn)等對酶活性沒有影響。 激活劑的作用機制是多種多樣的, 可能是作為輔酶或輔基的一個 組成局部, 也可以直接作為酶活性屮心

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論