生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)-酵母RNA的分離、組分鑒定及含量分析

1、編輯ppt編輯ppt1 1、掌握稀堿法分離酵母、掌握稀堿法分離酵母RNARNA的原理與操作過程。的原理與操作過程。2 2、了解、了解RNARNA的組分并掌握定性鑒定的具體方法。的組分并掌握定性鑒定的具體方法。3 3、學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定核酸含量的原理、學(xué)習(xí)紫外分光光度法測(cè)定核酸含量的原理和操作方法。和操作方法。 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?編輯ppt 本實(shí)驗(yàn)用本實(shí)驗(yàn)用0.2% NaOH 0.2% NaOH 使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋使酵母裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀 RNA RNA 。1. 1. 核酸分離核酸分離 原理原理 編輯ppt酶促

2、水解酶促水解化學(xué)水解化學(xué)水解: : 酸水解酸水解: :堿基、核糖堿基、核糖/ /脫氧核糖和磷酸脫氧核糖和磷酸 堿水解堿水解: :RNARNA存在存在2-OH2-OH，磷酸二酯鍵不穩(wěn)定，得單核苷酸，磷酸二酯鍵不穩(wěn)定，得單核苷酸2. 2. 組分鑒定組分鑒定RNA是由核糖、嘌呤/嘧啶堿和磷酸組成，提取得的 RNA 中加10% 硫酸煮沸即可得到這些組分的混合溶液 （$），分別進(jìn)行定性鑒定，以證明提取物是否為核酸。 原理原理 編輯ppt $ $編輯pptCHOCHOHCH2OH()3thick HClOCHOCH3HOOHF3+Green substance $ $ $ $編輯ppt3. RNA含量測(cè)定

3、含量測(cè)定核酸（核酸（DNADNA和和RNARNA）堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外區(qū)有較強(qiáng)吸收，吸）堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)在紫外區(qū)有較強(qiáng)吸收，吸收高峰在收高峰在260nm260nm波長(zhǎng)處，蛋白質(zhì)則在波長(zhǎng)處，蛋白質(zhì)則在280nm280nm波長(zhǎng)處。波長(zhǎng)處。當(dāng)當(dāng)ODOD2602601 1時(shí)，時(shí)，dsDNAdsDNA濃度約為濃度約為50g / ml50g / ml ssDNA ssDNA濃度約為濃度約為37g / ml37g / ml RNA RNA濃度約為濃度約為40g / ml40g / ml純純DNADNA：ODOD260260/OD/OD280280 ( (1.9,1.9,表明有表明有RNARNA污染；，表明有蛋

4、白質(zhì)、酚等污染）污染；，表明有蛋白質(zhì)、酚等污染）純純RNARNA：1.7 1.7 ODOD260260/OD/OD280280 （時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染（時(shí)表明有蛋白質(zhì)或酚污染, ,可以增加酚可以增加酚 / /氯仿抽提）氯仿抽提）編輯pptODOD260260/OD/OD280280的比值用于估計(jì)核酸的純度的比值用于估計(jì)核酸的純度,OD,OD260260/OD/OD230230估計(jì)去鹽的估計(jì)去鹽的程度。程度。 對(duì)于對(duì)于RNARNA純制品，其純制品，其ODOD260260/OD/OD280280，ODOD260260/OD/OD230230應(yīng)大于應(yīng)大于2 2。 OD OD260260/OD/OD

5、23023022說明去鹽不充分說明去鹽不充分, , 可以再次沉淀和可以再次沉淀和70%70%乙醇洗滌。乙醇洗滌。濃度計(jì)算：濃度計(jì)算：DNADNA樣品的濃度（樣品的濃度（g / lg / l）:OD:OD260260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)50/100050/1000RNARNA樣品的濃度（樣品的濃度（g / lg / l）：）：ODOD260260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)40/100040/1000編輯ppt1 1提取提取稱取干酵母粉，放入試管中，加入稱取干酵母粉，放入試管中，加入0.2% NaOH 3mL0.2% NaOH 3mL，然后放入沸水浴，然后放入沸水浴中提取中提取15min15min。2 2分離分

6、離用自來水冷卻用自來水冷卻, ,滴加滴加1-41-4滴醋酸，調(diào)滴醋酸，調(diào)pHpH至至（沉淀蛋白質(zhì)），（沉淀蛋白質(zhì)），裝入離心裝入離心管配平，管配平，3000r/min3000r/min離心離心3min3min，（使提取液與菌體殘?jiān)蛛x）（使提取液與菌體殘?jiān)蛛x）。3 3抽提抽提 收集上清液，加等體積的氯仿，震蕩混勻，收集上清液，加等體積的氯仿，震蕩混勻，3500r/min3500r/min離心離心5min5min。4 4沉淀沉淀RNARNA收集上清，平均分裝入兩支離心管中，各加收集上清，平均分裝入兩支離心管中，各加2 2倍體積無水乙醇，邊加倍體積無水乙醇，邊加邊攪拌，配平，邊攪拌，配平，350

7、0r/min3500r/min離心離心5min5min，得到，得到RNARNA沉淀。沉淀。棄去上清液（棄凈），一支離心管加棄去上清液（棄凈），一支離心管加5mL5mL蒸餾水回溶，以備濃度測(cè)定；蒸餾水回溶，以備濃度測(cè)定；另一支離心管加入另一支離心管加入5mL 10%5mL 10%的的 H H2 2SOSO4 4, ,然后轉(zhuǎn)入然后轉(zhuǎn)入50mL50mL三角瓶中，待用。三角瓶中，待用。 操作步驟操作步驟 注意配平、對(duì)稱放置離心管注意配平、對(duì)稱放置離心管編輯ppt編輯ppt編輯pptRNARNA的酸解的酸解將裝有待測(cè)將裝有待測(cè)RNARNA的三角瓶，在電爐上加熱，至溶液透明為的三角瓶，在電爐上加熱，至溶液

8、透明為止，得到止，得到RNARNA的水解液，期間不?；蝿?dòng)，以使受熱均勻。的水解液，期間不?；蝿?dòng)，以使受熱均勻。 注意注意 RNARNA加熱酸解時(shí)，一定注意觀察，本步很容易加熱過度，加熱酸解時(shí)，一定注意觀察，本步很容易加熱過度，使透明溶液變成黑褐色，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。使透明溶液變成黑褐色，而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。的組分鑒定的組分鑒定編輯ppt檢驗(yàn)項(xiàng)目檢驗(yàn)項(xiàng)目 嘌呤嘌呤 核糖核糖 磷酸磷酸 水水 解解 液液1mL1mL1mL1mL1mL1mL試試 劑劑NHNH3 3HH2 2O 2mL O 2mL AgNOAgNO3 3 1mL 1mL 苔黑苔黑-FeCl-FeCl3 3 1mL 1mL 定磷試劑定磷試劑

9、1mL 1mL SnClSnCl2 2 1-2 1-2滴滴 反應(yīng)條件反應(yīng)條件 不振動(dòng)不振動(dòng)觀察現(xiàn)象觀察現(xiàn)象沸水浴約沸水浴約10min10min振蕩混勻振蕩混勻室溫放置室溫放置現(xiàn)現(xiàn) 象象 白色絮狀沉淀白色絮狀沉淀 鮮綠色鮮綠色 蘭色蘭色 組分鑒定組分鑒定加蒸餾水將水解液稀釋至加蒸餾水將水解液稀釋至5mL5mL，然后按下表檢驗(yàn)，然后按下表檢驗(yàn)項(xiàng)目所需的量分裝三支試管中，進(jìn)行組分鑒定。項(xiàng)目所需的量分裝三支試管中，進(jìn)行組分鑒定。編輯ppt待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（如量取待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋（如量取100100L RNAL RNA水溶液，加水溶液，加29002900L L 蒸餾水混勻），用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定其蒸

10、餾水混勻），用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定其230nm230nm、260nm 260nm 和和280nm 280nm 的吸光度值。的吸光度值?？筛鶕?jù)自己的樣品濃度調(diào)整稀釋倍數(shù)。可根據(jù)自己的樣品濃度調(diào)整稀釋倍數(shù)。 黑體透射調(diào)零黑體透射調(diào)零 蒸餾水透射調(diào)蒸餾水透射調(diào)100100 吸收調(diào)零吸收調(diào)零含量測(cè)定含量測(cè)定注意保護(hù)石英比色皿，輕拿輕放！注意保護(hù)石英比色皿，輕拿輕放！編輯ppt配平：含液離心管與外套鐵管在一起兩組配平（先選兩個(gè)配平：含液離心管與外套鐵管在一起兩組配平（先選兩個(gè)外套鐵管重量接近）對(duì)稱放于離心機(jī)的鐵套中。外套鐵管重量接近）對(duì)稱放于離心機(jī)的鐵套中。設(shè)置：閉蓋，選離心機(jī)設(shè)置鍵（設(shè)置：閉蓋，選離

11、心機(jī)設(shè)置鍵（“亮點(diǎn)亮點(diǎn)”在轉(zhuǎn)速和時(shí)間的在轉(zhuǎn)速和時(shí)間的選擇上：可通過三角符號(hào)移位，然后再增減），設(shè)置數(shù)都選擇上：可通過三角符號(hào)移位，然后再增減），設(shè)置數(shù)都完成后再按確認(rèn)鍵。完成后再按確認(rèn)鍵。啟動(dòng)：使啟動(dòng)：使“亮點(diǎn)亮點(diǎn)”回到測(cè)定位置，按啟動(dòng)鍵。轉(zhuǎn)動(dòng)期間蓋回到測(cè)定位置，按啟動(dòng)鍵。轉(zhuǎn)動(dòng)期間蓋子打不開。子打不開。若聲音很大異常。立即按停止鍵。若聲音很大異常。立即按停止鍵。離心機(jī)的使用離心機(jī)的使用編輯ppt通過實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說明鑒定的結(jié)果，由結(jié)果進(jìn)一步說明通過實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說明鑒定的結(jié)果，由結(jié)果進(jìn)一步說明你的提取物是什么？你的提取物是什么？計(jì)算計(jì)算RNARNA溶液濃度及酵母溶液濃度及酵母RNARNA得率，并判斷樣品純度。得率，并判斷樣品純度。將組分定性鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果交老師過目評(píng)分，然后清將組分定性鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果交老師過目評(píng)分，然后清洗離心管，整理實(shí)驗(yàn)臺(tái)，用