HE石蠟切片步驟,免疫組化步驟

1、HE染色切取的組織塊不宜太大,以利于固定劑穿透,通常以6mm×6mm×5mm為宜。注意事項(xiàng):(1取材動(dòng)作要迅速,不宜作太久的拖延以免組織細(xì)胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。(2切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進(jìn)行選,盡可能不要損傷所需要的部分。將切好的組織用生理鹽水組織洗3次,立即投入10%中性福爾馬林固定液或4%多聚甲醛中固定,固定36小時(shí)。注意事項(xiàng):(1一般固定液,都以新配為好,配好后應(yīng)貯存在陰涼處,不宜放在日光下,以免引起化學(xué)變化,失去固定作用。(2有些混合固定液的成份之間會(huì)發(fā)生氧化還原作用,一定要在使用前才混合,如果混合太早,固定時(shí)就沒有作用了。(3固定材料時(shí),固定液必須充足,

2、一般為材料塊的2030倍,有些水分多的材料,中間應(yīng)更換1-2次新液。(4材料固定完畢后,保存于嚴(yán)密緊塞或加蓋的容器里,同時(shí)在容器外上標(biāo)簽,并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標(biāo)簽,以免相互混淆。標(biāo)簽上注明固定液、材料來源、日期等。標(biāo)簽上的文字,應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。脫鈣72小時(shí)中間不換液是樣本30倍中杉金橋(進(jìn)口脫鈣液鑷子觸質(zhì)粒由硬變韌性為準(zhǔn)。(美:固定3-5天根據(jù)組織大小確定天數(shù),越大固定時(shí)間越長(zhǎng)。3. 洗滌材料經(jīng)固定后,PBS或雙蒸水沖洗約3小時(shí)。(20,30,30,60(美:流水沖洗約4小時(shí)4. 脫水材料依次經(jīng)80%、90%、100%、100%各級(jí)乙醇溶液脫水,各30min注意事項(xiàng):(1

3、脫水必須在有蓋的玻璃品中進(jìn)行,防止吸收空氣中的水分。(2在更換高一級(jí)的脫水劑時(shí),最好不要移動(dòng)材料以免損壞,可用吸管吸出器皿中的脫水劑,再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液,然后于皿中加入高一級(jí)脫水劑。(3在低濃度酒精中,每級(jí)停留不宜太長(zhǎng),否則易使組織變軟,助長(zhǎng)材料的解體。(4在高濃度或純酒精中,每級(jí)停留的時(shí)間也不宜太長(zhǎng),否則會(huì)使組織變脆,影響切片。(5如需過夜,應(yīng)停留在80%酒精中。(6脫水必須徹底,否則不易透明,甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象(美:80%的酒精×2小時(shí)95%的酒精×2小時(shí)100%的酒精×2小時(shí)×2100%的酒精×1小時(shí)或者更長(zhǎng)時(shí)間5.透明

4、(環(huán)保透明脫蠟液中杉金橋純酒精、二甲苯等量混合液15min,二甲苯60min、30min(至透明為止。由于乙醇與石蠟不相溶,而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟,所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當(dāng)組織中全部被二甲苯占有時(shí),光線可以透過,組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。透明注意事項(xiàng)(1使用透明劑時(shí),要隨時(shí)蓋緊蓋子,以免空氣中的水分進(jìn)入。(2更換每級(jí)透明劑,動(dòng)作要迅速,一方面為了不使材料塊干涸,另一方面能避免吸收濕氣。(3在透明過程中,如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀,說明材料中的水未被脫凈,應(yīng)退回純酒精中重新脫水,然后再透明。(美:二甲苯 2小時(shí)二甲苯 2小時(shí)二甲苯 2小時(shí)放入二甲苯和石蠟各半的混合液60mi

5、n,再放入石蠟60分鐘、石蠟透蠟30分鐘。透蠟的目的是除去組織中的透明劑(如二甲苯等,使石蠟滲透到組織內(nèi)部達(dá)到飽和程度以便包埋。透蠟時(shí)間根據(jù)組織大小而定。透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進(jìn)行,并保持箱內(nèi)溫度在55-60左右,注意溫度不要過高,以免組織發(fā)脆。一般置于恒溫箱0.5h。透蠟注意事項(xiàng)(1盡量保持在較低溫度中進(jìn)行,以石蠟不凝固為度;(2透蠟溫度要恒定,不可忽高忽低;(3操作要迅速,力求在最短的時(shí)間內(nèi)完成石蠟透入過程,以免引起組織變硬、變脆、收縮等。(美:石蠟 2小時(shí)石蠟 2小時(shí)石蠟 2小時(shí)7. 包埋包埋時(shí),用鑷子夾取石蠟?zāi)Ｗ?金屬質(zhì)地在酒精燈上稍加熱,放在平的桌面上,從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯,倒入少

6、許石蠟。再將鑷子稍加熱,夾取材料將切面朝下放入蠟?zāi)Ｖ?排列整齊。再放上包埋盒,輕輕倒入熔蠟。8. 切片將已固定和修好的石蠟塊裝在切片機(jī)的夾物臺(tái)上。將切片刀固定在刀夾上,刀口向上。搖動(dòng)推動(dòng)螺旋,使石蠟塊與刀口貼近,但不可超過刀口。調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置,刀片與石蠟切片約成15度左右。調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度,一般為4-10微米。一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時(shí)右手搖動(dòng)轉(zhuǎn)輪,讓蠟塊切成蠟帶,左手持毛筆將蠟帶提起,搖轉(zhuǎn)速度不可太急,通常以40-50r/min。切成的蠟帶到20-30cm長(zhǎng)時(shí),右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起,以免卷曲,并牽引成帶,平放在蠟帶盒上,靠刀面的一面較光滑,朝下

7、,較皺的一面朝上。用單面刀片切取蠟片一小段,放在載玻上加水一滴,置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。切片工作結(jié)束后,應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟,把切片機(jī)擦拭干凈妥為保存。9. 展片、貼片打開水浴鍋,使水溫維持在40-45,另準(zhǔn)備30%乙醇溶液。切片時(shí),將一碗30%乙醇溶液放于切片機(jī)旁的桌面上。用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶,放在乙醇溶液的水面上,使切片展開。(可省小鑷子輕輕地將連在一起的切片分開,用一個(gè)載玻片將切片完整,已展開的切片撈至溫水中,使之充分展開。另取潔凈的載玻片,撈起展開的切片,使其位于切片1/3處,另一端(磨邊,粗糙的一端磨面上標(biāo)記或貼上標(biāo)簽,放于切片架上。10.

8、 脫蠟復(fù)水將溫箱溫度調(diào)至65,待溫度控制在60時(shí),將切片連同切片架放入干燥的溫箱內(nèi)3-5小時(shí)至蠟熔化。之后,石蠟切片經(jīng)脫蠟透明、脫蠟各20min,勿動(dòng)(防治組織掉此步為關(guān)鍵步,請(qǐng)輕拿輕放。然后放入100%、95%、90%、80%、70%各級(jí)酒精溶液中各5min,再放入蒸餾水中3min。切片放入蘇木精中染色約10-30min。染色時(shí)間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低,適當(dāng)縮短或延長(zhǎng)。室溫高時(shí)促進(jìn)染色,染色時(shí)間可短些,否則可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間,冬季室溫低時(shí)可放入恒溫箱中染色。用自來水流水沖洗約15min。使切片顏色變藍(lán)(或放入堿性水中也可,但要注意流水不能過大,以防切片脫落。將切片放入1%鹽酸乙醇液中褪

9、色,約2秒至數(shù)十秒鐘。見切片變紅,顏色較淺即可。14.漂洗(反藍(lán)切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍(lán)色。15.脫水切片入50%乙醇70%乙醇80%乙醇中各5min。(沒放5016、復(fù)染用0.5%伊紅乙醇液對(duì)比染色1-3min。伊紅主要染細(xì)胞質(zhì),著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細(xì)胞核的濃淡相配合,如果細(xì)胞核染色較濃,細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)濃染,以獲得鮮明的對(duì)比。反之,如果細(xì)胞核染色較淺,細(xì)胞質(zhì)也應(yīng)淡染?？稍谝良t乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染,促使細(xì)胞質(zhì)容易著色,并且經(jīng)乙醇脫水時(shí)不易褪色。17.脫水將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色,然后放入無水乙醇中3-5min。最后用吸水紙吸干多余的乙醇。切片放入二甲苯、中各5min。二甲

10、苯應(yīng)盡量保持無水,應(yīng)經(jīng)常更換,或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象,說明脫水未盡,應(yīng)退回乙醇中重新脫水,否則切片難以鏡檢。19.封藏:中性樹膠封存因切片經(jīng)二甲苯透明,使用中性樹膠作為封藏劑,樹膠可用二甲苯稀釋至合適的稠度。封藏的方法:封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小,選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后,在桌上放一張潔凈的吸水紙,將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上(切片的一面向上,迅速地在切片的中央滴一滴樹膠(千萬不能待二甲苯干燥后再進(jìn)行,用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè),稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角,然后再緩慢地將蓋玻片放下,這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。如膠液不

11、足,可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補(bǔ)足。如膠液過多,可在干燥以后用刀刮去,并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。染色結(jié)果:細(xì)胞核被蘇木素染成藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。免疫組化染色1. 石蠟切片,步驟同前。切片經(jīng)貼片后,60烤片30min使蠟熔化,經(jīng)二甲苯、各10min,脫蠟。然后,將切片放入100%、95%、90%、80%、70%乙醇中3-5min,再放入蒸餾水中3min,水化。2.脫蠟和水化后,用PBS(pH7.4,具體看所用抗體及染色試劑說明沖洗3次,每次3分鐘。洗瓶沖洗。3. 根據(jù)抗體的要求,對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。可選步驟,具體見抗體說明書。4.每張切片加1滴或50l 3%過氧化氫,室溫下孵育10分鐘,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3次,每次3分鐘。此步驟是對(duì)內(nèi)源性過氧化物酶含量高的組織而言。4. 除去PBS液,每張切片加1滴或50l的第一抗體,室溫下孵育60分鐘或4過夜,具體參見每種抗體的說明書。PBS沖洗3次,每次3分鐘。5. 除去PBS液,每張切片加1滴或50l 即用型MaxVisionTM 試劑或SP試劑,室溫下孵育10-15分鐘。PBS沖洗3次,