國標-》桉樹無性系組培快繁技術(shù)規(guī)程

1、ICS 65020B 64y中華人民 共禾口 國林業(yè)行業(yè)標準LYT 1 770-2008桉樹無性系組培快繁技術(shù)規(guī)程Tissue culture of eucalyptus clones2008-09-03發(fā)布2008-12-01實施國家林業(yè)局發(fā)布LYT 1770-2008目次前言 1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14繁殖材料來源 25外植體的采集、消毒與接種 一26培養(yǎng)基的配制 37接種 - - 。 - - 38增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)與煉苗 ”49田聞移栽與蓖木管理 “510苗木出圃 一61l組培廠管理 6 附錄A(資料性附錄)尾巨桉組培快繁培養(yǎng)基配方 一7 附錄B(資料性附錄)桉樹組

2、培苗病蟲害主要特征 。8 附錄c(資料性附錄)作業(yè)設(shè)計用表 9 附錄D(資料性附錄)外植體采集與繁殖材料更新表 12 參考文獻 13LYT 1770-2008刖苗本標準附錄A、附錄B、附錄c和附錄D均為資料性附錄。 本標準由中國林業(yè)科學研究院提出。 本標準由全國林木種子標準化技術(shù)委員會歸口。 本標準負責起草單位：中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所。 本標準參加起草單位：廣東省湛江萬泉林業(yè)生物技術(shù)研究所。本標準主要起草人：曾炳山、徐大平、裘珍飛、劉英、李湘陽、周憲生。LYT 1770-2008桉樹無性系組培快繁技術(shù)規(guī)程1范圍本標準規(guī)定了熱帶、南亞熱帶桉樹無性系組織培養(yǎng)快繁種苗的一般原則，包括母樹的

3、選取、外植體采集與處理、培養(yǎng)基配制、無菌操作、組培苗移植、苗木管理與出圃、廢棄培養(yǎng)基處理等方面的原則。本標準適用于組培工廠的桉樹無性系苗木生產(chǎn)，苗木用于造林和建立采穗圃。2規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有 的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究 是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB 6000主要造林樹種苗木質(zhì)量分級GBT 6001育苗技術(shù)規(guī)程LYT 1000容器育苗技術(shù)3術(shù)語和定義 下列術(shù)語和定義適用于本標準。31褐變browni

4、ng外植體或培養(yǎng)材料釋放出酚類物質(zhì)，經(jīng)氧化產(chǎn)生醌類物質(zhì)的現(xiàn)象。褐變對外植體或培養(yǎng)材料具有 一定的毒害作用。32污染contamination培養(yǎng)基或培養(yǎng)材料生長有真菌或細菌等微生物的現(xiàn)象。33母液stock solution為稱量準確和方便，將培養(yǎng)基的成分配制成一定濃度和比例的溶液或混合溶液。34光培養(yǎng)light culture有光照的培養(yǎng)。通常的植物組織培養(yǎng)，每天均需要12 h16 h的光照。35暗培養(yǎng)dark culture全天無光照的培養(yǎng)。外植體培養(yǎng)初期或愈傷組織再生時，有些植物需要暗培養(yǎng)。36增殖培養(yǎng)proliferation culture 繼代培養(yǎng)subculture 離體芽苗、愈

5、傷組織或懸浮培養(yǎng)細胞不斷倍增的培養(yǎng)過程。37生根培養(yǎng)rooting culture誘導無根離體芽苗產(chǎn)生根的培養(yǎng)過程。1LYT 1770-200838瓶苗tube seedling 試管苗 通過植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生的離體小植株。39叢芽shoot clump由多個基部相連的離體小芽組成的一團芽。310瓶苗煉苗acclimatization將組培苗連培養(yǎng)容器一起移至室外近自然環(huán)境中培養(yǎng)，提高苗木的木質(zhì)化程度，增強苗木對自然光 照和溫差變化適應(yīng)能力的過程。311移栽outplanting 移植 將組培苗種植到苗圃，并使苗木逐漸適宜自然條件的過程。312采穗母苗hedge seedling用于建采穗圃的苗

6、木。4繁殖材料來源 采集外植體的母樹應(yīng)是省級以上良種審(認)定的無性系原株和早期無性系分株。5外植體的采集、消毒與接種51外植體的采集與處理511將母樹環(huán)割或伐倒，采集萌芽條做外植體?；虿杉笜涞闹l，嫁接到同種桉樹或父母本桉樹的小苗砧木上，采集接穗上萌發(fā)的枝條做外植體。512宜在生長旺盛的季節(jié)，選擇連續(xù)晴天3天以上的天氣，采集半木質(zhì)化、生長旺盛和無病蟲害的枝 段做外植體。513采集外植體時，應(yīng)對每個無性系或優(yōu)樹的外植體加標簽，標明無性系、采集地點、采集時間等。514宜當天采集，當天消毒。若需要長途運輸或儲藏2日3日，宜用保濕材料包扎，以免外植體失 水。不宜向外植體或包扎材料噴水，否則容易污染

7、。52外植體表面消毒521 消毒前用洗潔劑將外植體洗凈，并用自來水沖洗15 min20 rain。522在超凈工作臺中，用75酒精消毒8 s10 S，無菌水沖洗1次。523用01氯化汞加4滴5滴吐溫一20的消毒液浸投材料，輕微搖動，嫩枝段消毒2 min5 rain，老枝段消毒6 minlO min，后用無菌水沖洗4次5次，每次8 min10 min。524使用后的氯化汞消毒液應(yīng)按照國家有關(guān)劇毒化學藥物使用的法規(guī)進行處理。525采白干凈少菌環(huán)境的外植體或已用殺菌劑控制雜茵的外植體，可用10的次氯酸鈣消毒液消毒，嫩枝段10 min15 rain，老枝段15 min20 rain。消毒后用無菌水沖洗

8、2次3次，每次8 min10min。53外植體接種531將消毒后的外植體切成含有1個2個腋芽的枝段，垂直或略傾斜接種到叢芽誘導培養(yǎng)基上。532為了防止褐變，有些無性系的外植體接種后宜暗培養(yǎng)5天7天后再轉(zhuǎn)入光培養(yǎng)。2LYT 1770-20086培養(yǎng)基的配制61培養(yǎng)基成分611培養(yǎng)基宜含有氮、磷、鉀、鈣、鎂等大量元素，鐵、鋅、錳、銅、鉬、鈷、碘、硼等微量元素，肌醇、甘氨 酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、生物素等有機營養(yǎng)成分，維生素c、半胱氨酸和聚乙烯吡咯烷酮等抗 褐變劑，細胞分裂素和生長素等植物生長調(diào)節(jié)劑，糖以及凝固劑瓊脂或卡拉膠。612培養(yǎng)基應(yīng)分為叢芽誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。三種培

9、養(yǎng)基的主要差別是大量元素 和植物生長調(diào)節(jié)劑的組成與含量。613不同無性系的培養(yǎng)基配方有所不同，需要調(diào)整主要成分銨態(tài)氮的含量、激素的含量、大量元素的總含量等。以尾巨桉為例，叢芽誘導培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基三種培養(yǎng)基的配方參見附錄A。62母液配制621母液宜分為大量元素母液、微量元素母液、有機營養(yǎng)成分母液和植物生長調(diào)節(jié)劑母液。蔗糖、瓊脂或卡拉膠和聚乙烯吡咯烷酮不宜配成母液，需要時直接稱樣。622大量元素母液和有機營養(yǎng)成分母液的各組分濃度應(yīng)與培養(yǎng)基的組分濃度成50100的倍數(shù)關(guān)系，微量元素母液成200500的倍數(shù)關(guān)系，而植物生長調(diào)節(jié)劑母液宜配成05 mgmL或10 mgraL。623母液宜用無

10、菌的蒸餾水、去離子水或超純水配制。624配制大量元素母液時，每個組分應(yīng)單獨溶解，后按氮、磷、鈣、鎂的順序逐個混合，否則容易引起 沉淀。625微量元素母液應(yīng)用棕色瓶保存，植物生長調(diào)節(jié)劑母液和有機物母液應(yīng)置于冰箱中保存。626母液配制后應(yīng)及時使用，貯存時間不宜超過1個月。母液如有沉淀，或有微生物和藻類生長，應(yīng)廢棄不用。63培養(yǎng)基配制631依照培養(yǎng)基配方，按比例吸取母液放入容量瓶，加水定容后轉(zhuǎn)至不銹鋼鍋等容器內(nèi)。632加入適量凝固劑和糖，并攪拌使凝固劑充分分散，糖充分溶解。633加熱至剛沸騰，使凝固劑完全溶解。若采用邊分裝邊攪拌的自動化儀器配制培養(yǎng)基時，可省去加熱使凝固劑溶解的過程。634用10 m

11、olL鹽酸或10 molL氫氧化鈉調(diào)整至適當?shù)乃釅A度。635盡快將培養(yǎng)基分裝到培養(yǎng)器皿內(nèi)，以免培養(yǎng)基凝固或變稠而難以分裝。636分裝培養(yǎng)基時應(yīng)避免培養(yǎng)基粘到瓶口，一旦粘上，應(yīng)擦除干凈，否則容易引起枵染。64培養(yǎng)基消毒641將分裝好的培養(yǎng)基放入高壓消毒鍋內(nèi)消毒。642加熱初期，當消毒鍋消毒室的氣壓達005 MPa時，打開冷凝閥，排盡消毒室內(nèi)冷空氣。643當消毒室內(nèi)氣壓達到011 MPa、溫度達121時，開始計時，保持溫度與壓力消毒15 rain20rain。644關(guān)閉加熱電源開關(guān)，按慢排方式排放熱氣，待消毒室內(nèi)的氣壓降至大氣壓時才取出培養(yǎng)基。645培養(yǎng)基應(yīng)置于無風和干凈的環(huán)境中冷卻，或用高壓高溫

12、消毒過的厚布包裹培養(yǎng)基進行冷卻。646消毒鍋的使用和檢測應(yīng)按照勞動部門的法規(guī)執(zhí)行。65培養(yǎng)基儲藏培養(yǎng)基應(yīng)盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，也可在干凈無風的環(huán)境中儲藏培養(yǎng)基，但儲藏時間不應(yīng)超過1個月。7接種71準備工作711接種人員宜著干凈的工作服、拖鞋和口罩，接種前還應(yīng)用洗潔劑洗手。LYT 1770-2008712接種器皿應(yīng)先用消毒鍋消毒后備用。713長時間未用的超凈工作臺，應(yīng)用75酒精將其臺面、兩側(cè)擋板、紫外燈和接種工具的灰塵擦 干凈。714開啟工作臺的紫外燈，利用紫外線殺菌25 min30 min。715開啟超凈工作臺的風機通風15 rain。716超凈工作臺連續(xù)使用4 h后應(yīng)重新進行清潔、紫外燈殺菌和開風機

13、通風等處理。717開關(guān)紫外燈時，工作人員應(yīng)注意避免紫外線損傷皮膚和眼睛。718工作人員應(yīng)在關(guān)閉紫外燈15 rain后進行接種操作，以免臭氧損傷呼吸道。72接種721用酒精燈或電熱消毒器將剪刀、鑷子、刀片等接種工具消毒，消毒后應(yīng)適當冷卻，避免燙傷培養(yǎng) 材料。722在無菌的接種器皿中，將叢芽切分成小芽叢或單個芽，后將小芽叢接種到新鮮的增殖培養(yǎng)基上 繼續(xù)增殖，將單個芽接種到生根培養(yǎng)基上誘導生根。723每個培養(yǎng)器皿中接種小芽叢或芽的數(shù)量適中，深淺適中。分布均勻。724每轉(zhuǎn)接完一個培養(yǎng)器皿中的培養(yǎng)材料，均應(yīng)擦凈接種工具上的培養(yǎng)基，按721的方法將接種 工具重新消毒一次，同時更換接種器皿，避免交叉污染。7

14、25轉(zhuǎn)接完成后，應(yīng)在培養(yǎng)器皿上標注接種日期、無性系編號或名稱。726接種過程中，接種人員宜避免說話，避免動作幅度過大過猛，以減少污染培養(yǎng)材料的機率。727每次接種完畢，應(yīng)用75酒精將工作臺上的接種工具、臺面和兩邊擋板等擦洗干凈。73接種環(huán)境731定期打掃、清潔接種問，并每月用40甲醛加少量高錳酸鉀熏蒸消毒1次。732定期清潔超凈工作臺的初級過濾膜。8增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)與煉苗81增殖培養(yǎng)811培養(yǎng)室的溫度宜為2428，培養(yǎng)器皿上部的光照強度宜為1 500 lx3 000 Ix，光照時問 宜為每天10 h16 h。812及時清除污染的培養(yǎng)材料，并定期打掃、清潔培養(yǎng)室。813定期將培養(yǎng)材料轉(zhuǎn)接至新鮮

15、培養(yǎng)基，達到增殖擴繁的目的。814從外植體開始，培養(yǎng)時間超過4年，繼代培養(yǎng)超過60代，應(yīng)重新采集外植體更新培養(yǎng)材料。82生根培養(yǎng)821選擇粗壯的增殖芽苗進行生根培養(yǎng)，且應(yīng)切分為單個芽，避免兩個以上的芽連在一起生根。822生根培養(yǎng)的溫度、光照強度和光照時間可與增殖培養(yǎng)相同。823部分無性系初期4天5天可能需要暗培養(yǎng)。824污染的生根芽苗應(yīng)廢棄。83瓶苗煉苗831生根培養(yǎng)后期至田間移植前，應(yīng)于溫室或不淋雨的大棚內(nèi)煉苗，使芽苗適應(yīng)自然光照和晝夜溫 差。光照弱、溫度低的冬春季節(jié)，煉苗時間宜為15天25天。溫度高、光照強的夏秋季節(jié)，煉苗時間宜 為10天15天。832適宜煉苗的光照強度為5 000 lx8

16、 000 lx和環(huán)境溫度為1030，避免強光和高溫灼傷 芽苗。833移植前2天3天可適當松開或打開培養(yǎng)器皿，使芽苗逐步適應(yīng)濕度小的自然環(huán)境。834煉苗過程中污染的生根芽苗宜廢棄。dLYT 1770-200884瓶苗質(zhì)量要求841瓶苗可供應(yīng)給扦插苗圃或造林客戶進行田間移植。842合格的瓶苗要求達到： a)苗高25 cm45 cm。 b)芽苗莖基韌皮部生根1條以上，總根長大于15 cm。c)莖基部的愈傷組織小于莖直徑的2倍，葉片和頂芽無愈傷組織。d)經(jīng)過室外自然光煉苗，葉色正常。e)無微生物污染。843瓶苗苗高的測量方法：將苗木自然平放，最上部生根處至頂芽的垂直距離為苗高。844瓶苗總根長的測量方

17、法：苗木莖至根尖的長度為根長，逐條根測定根長，累計為總根長。85瓶苗的清洗、包裝和運輸851煉苗結(jié)束后，從培養(yǎng)器皿中取出組培苗，并用清水洗去粘附于苗上的培養(yǎng)基。取苗和洗苗動作 要輕，避免折斷和損傷芽苗。852用保鮮盒或塑料泡沫箱包裝瓶苗，并加膠帶密封。包裝容器的內(nèi)空高度大于苗木高度5倍以上。853包裝過程中應(yīng)盡量避免擠壓苗木。854運輸過程中避免劇烈顛簸或翻轉(zhuǎn)包裝容器。855運輸和儲藏過程中，環(huán)境溫度應(yīng)在1030之間，陽光照射和車輛馬達等導致的高溫易使 苗木失去活力。856從出瓶至種植完畢，高溫季節(jié)不超過3天，冬季不超過5天。86廢棄培養(yǎng)基的處理 廢棄的培養(yǎng)基應(yīng)收集曬干，作垃圾丟棄?；蚨褲a半個

18、月至一個月，作為有機肥料使用。不應(yīng)直接排入水體，導致水體富養(yǎng)分化。9田問移栽與苗木管理91基質(zhì)與容器911移苗基質(zhì)應(yīng)少菌、通氣和保水，可為輕型基質(zhì)、黃心土、細沙等，或多種材料混合而成。912基質(zhì)中宜添加12 000含磷12的磷肥，過多肥料會降低移栽成活率。913移栽前1至2天，應(yīng)用01o2高錳酸鉀等消毒液將基質(zhì)淋透消毒。914宜用容器培育組培苗。采用營養(yǎng)袋育苗時，規(guī)格宜為7 cmii cm或8 emXl2 cm。采用育苗管、蜂窩育苗筐、纖維網(wǎng)袋等容器育苗時，宜采用相適應(yīng)的輕型基質(zhì)。92移栽921移栽可在林地簡易苗圃、常規(guī)苗圃或溫室進行，對苗圃的要求見GBT 6001和LYT 1000。922選

19、擇林地簡易苗圃和常規(guī)苗圃時，避免選用3年內(nèi)種植過易發(fā)青桔病作物的地塊。923春季、初夏、晚秋和冬季適宜于移植組培苗，高溫的7月至8月則宜避開。924在露天苗圃移栽，宜選擇風小、陽光弱的天氣或時段進行。925移栽動作要輕，避免折斷和損傷芽苗。93苗木管理931移栽初期宜用薄膜等覆蓋保濕，并適時噴霧或淋水，保持濕度8095為宜。932育苗水源應(yīng)干凈少菌，避免使用可能被作物青枯菌污染的水源育苗。933移栽初期應(yīng)控制光照強度，遮陽8590為宜，中后期逐漸加強光照。934苗木長出新葉后，每星期噴施或淋施005o1的復(fù)合肥溶液1次。935露天苗圃移植，苗木高度小于8 m時，雨天應(yīng)加蓋薄膜避雨。5LYT 1

20、770-2008936定期噴施多菌靈、百菌清、甲基托布津等殺菌荊，防止小苗腐爛和發(fā)生病害。937定期檢查白蟻、地老虎、蟋蟀、金龜子、桉小卷蛾等蟲害的發(fā)生情況，及時防治。938苗木出圃后。應(yīng)清除雜物，并用生石灰等消毒劑對圃地進行消毒。939當苗木青桔病的發(fā)病率超過3時，宜更換或輪作苗圃地，或在苗圃地覆蓋10 ctn以上的無菌 黃心土，并用壓路機等機械壓實。94袋苗煉苗941袋苗出圃前，宜通過搬動、減少水分供應(yīng)、加強光照等措施進行煉苗，提高造林成活率。942溫度低、雨水多的春季出圃，煉苗強度宜小。高溫強光照的夏季出圃，煉苗強度宜大。943不應(yīng)使用生長抑制來控制苗木高度，否則苗木造林后長時間不能恢復(fù)

21、生長。10苗木出圈101質(zhì)量要求1011采穗母苗：苗高10 cm20 cm，地徑大于010 ClTI，葉色與生長正常，無青枯病、焦枯病、大袋蛾、桉小卷蛾、葛氏長蠣盾蚧等檢疫病蟲害。冬季培育的苗木，苗齡不宜超過6個月。其他季節(jié)不宜超過5個月。1012造林苗：苗高15 cm35 cm，地徑大于013 cm，葉色與生長正常，無青枯病、焦枯病、大袋蛾、 桉小卷蛾、葛氏長蠣盾蚧等檢疫病蟲害。冬季培育的苗木，苗齡不宜超過6個月，其他季節(jié)不宜超過5個月。1013病蟲害的主要特征參見附錄B。102分級按照GB 6000進行分級。103包裝與運輸1031起苗前宜淋足水分。1032營養(yǎng)袋苗宜先裝入塑料筐等容器后再

22、裝車，不宜直接堆放于車上運輸，避免過多的損耗和損傷。1033常規(guī)車輛的運輸時間不宜超過2天，避免失水或腐爛。11組培廠管理111生產(chǎn)計劃與作業(yè)設(shè)計應(yīng)制定包括瓶苗生產(chǎn)計劃、袋苗生產(chǎn)計劃、作業(yè)方法、產(chǎn)量質(zhì)量、勞動定額、材料消耗、育苗成本等內(nèi) 容的作業(yè)設(shè)計。作業(yè)設(shè)計的部分用表可參照附錄c。112技術(shù)檔案應(yīng)建立組培工廠設(shè)計施工圖、消毒鍋檢測、外植體采集與繁殖材料更新、作業(yè)設(shè)計任務(wù)書、苗木產(chǎn)量 質(zhì)量、苗木成本、消耗定額、科學實驗設(shè)計與結(jié)果、田間病蟲害和災(zāi)害調(diào)查等檔案。外植體采集與繁殖材 料更新表可參照附錄D。113科學實驗宜針對苗木生產(chǎn)中關(guān)鍵問題，開展新無性系組培配方研制、操作新方法、生產(chǎn)機具改良和革新

23、、新技 術(shù)、新容器、新基質(zhì)等實驗活動。114效益考核宜分別瓶苗和袋苗核算苗木生產(chǎn)成本，發(fā)現(xiàn)和挖掘苗木生產(chǎn)中的問題與潛力。提高效率和經(jīng)濟效益。LYT 1770-2008附錄A (資料性附錄) 尾巨桉組培快繁培養(yǎng)基配方表A1藥品類別 藥品名稱 叢芽誘導培養(yǎng)基(mglL) 增殖培養(yǎng)基(mgL)生根培養(yǎng)基(mgL) KN旺 1 8001 800250NHN03720720200KH2Pq 270270335a)大量元素Ca(N03)#500500250CaCl22H20 10010075MgSq7H20370370250MnSO|4H：O 223223223ZnSq7H20 101010H3803 1

24、010 10NazMoO2H20 025025025b)微量元素FeSO,7H20 278278278NaEDTA373373373K1 083083083CuSO5HzO 002500250025CoCl26H20 002500250025 氨基乙酸 33 2 鹽酸硫胺素 7 7 3鹽酸吡哆醇2 2 15c)有機質(zhì)煙酸 443肌醇 100100100生物素 03 03 01d)糖蔗糖 30 00030 00020 000維生素c101010L-半骯氨酸5 5 1e)防褐變劑聚乙烯吡咯烷酮400400活性炭 016一BA105N從03 02f)激素IBA05ABTl 05g)凝固劑卡拉膠 9

25、200 9 200 9 200注：FeSq7H：O應(yīng)先與NayrA配制成絡(luò)和物，而后才與其他溶液混合。7LYT 1770-2008附錄B (資料性附錄) 桉樹組培苗病蟲害主要特征表B1病蟲害名稱 病原菌或害蟲學名主要特征a)苗木萎蔫或枯死，葉子枯而不脫落。b)苗莖木質(zhì)部變黑或綠色表皮有黑色茵斑。 青枯病 Ralstonia如la，mce口rMmc)根部腐爛壞死，有臭味。d)腐爛根系和病莖橫切并泡于清水中可溢出黃色或黃白色菌膿。a)葉片病斑淡黃褐色，邊緣水漬狀。Cylindrocladiumquinque-焦枯病 b)苗莖病斑褐色，稍顯縊縮有縱裂。septatum或Cscoparlumc)病莖和病葉背面在潮濕情況下產(chǎn)生踢顯白色霉狀物。大袋蛾 Clania Mzriegata褐色幼蟲吐絲制成袋囊，并背袋囊移動。 桉小卷蛾 Strepsicrates holotephras幼蟲淺綠色，將頂芽嫩葉綴合成苞。 葛氏長蠣盾蚧Mytilaspis gloverii蚧殼黃褐色，長1 mm3 mm。8U|T 1770-2008附錄c (資料性附錄) 作業(yè)設(shè)計用表表c1瓶苗生產(chǎn)計劃表 年度接生根 溫室煉苗 接種苗數(shù) 污染率出瓶數(shù) 平均高 平均生根條數(shù) 平均生根長度 出瓶 無性系時間 時間萬株 萬株 條時期表C2袋苗生產(chǎn)計劃裹年度 施