注射用頭孢曲松鈉中抗氧劑測定方法的建立

1、注射用頭孢曲松鈉中抗氧劑測定方法的建立    【摘要】  目的 建立測定注射用頭孢曲松鈉中抗氧劑2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚(BHT)的HPLC方法。方法 Alltima C18色譜柱(4.6mm×250mm，5m)，以乙腈水(7723)為流動相，檢測波長208nm，流速1.0ml/min，柱溫為室溫。結(jié)果 色譜圖中抗氧劑BHT與其他成分的分離度及其檢出靈敏度完全滿足檢測要求，最小檢出量為1.3ng。結(jié)論 本法簡便、專屬、能有效控制產(chǎn)品的質(zhì)量。 【關(guān)鍵詞】  抗氧劑； 頭孢曲松鈉； 高效液相色譜法  &

2、#160; ABSTRACT  Objective  To develop an HPLC method for determination of butylated hydroxytoluene (BHT) in ceftriaxone sodium for injection.  Methods  BHT and other related substances in ceftriaxone sodium were separated by a mobile phase consisted of acetonitrilewater (7723, V/

3、V) at a flow rate of 1.0ml/min on an Alltima C18 column and detected at 208 nm.  Results  The resolution and sensitivity of BHT were acceptable. The detection limit was 1.3 ng.  Conclusions  This method simple and specific to be used for the quality control of ceftriaxone soeium

4、for injection.    KEY WORDS  Antioxidant;  Ceftriaxone sodium;  HPLC    頭孢曲松鈉(ceftriaxone sodium)是由瑞士Roche公司在20世紀(jì)80年代推出的第三代頭孢菌素。貯存過程中，注射用頭孢曲松鈉溶液易變混濁以至澄清度不符合中國藥典的規(guī)定。在2000年全國注射用頭孢曲松鈉監(jiān)督抽驗(yàn)中共抽查126個批次，22批不合格，其中溶液澄清度不合格的有16批，占不合格樣品總數(shù)的73%1。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，膠塞與頭孢曲松鈉的相容性是導(dǎo)

5、致注射用頭孢曲松鈉貯存過程中溶液澄清度變混濁的主要原因，已有關(guān)于藥用丁基膠塞與頭孢曲松鈉相容性的研究2。但是，受藥品本身穩(wěn)定性、藥品流通貯存環(huán)境等因素的影響，膠塞與頭孢曲松鈉的配伍相容性難題上一直沒有實(shí)質(zhì)性的突破，也尚未見何種物質(zhì)導(dǎo)致注射用頭孢曲松鈉貯存過程中溶液變混濁的詳細(xì)報道。我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，藥用丁基膠塞的成分之一抗氧劑2，6-叔丁基-4-甲基-苯酚(BHT)可以在注射用頭孢曲松鈉樣品中被檢出，并在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)抗氧劑BHT是影響頭孢曲松鈉的溶液澄清度的物質(zhì)之一3。BHT本身是一種酚類抗氧劑，能抑制或減緩高分子材料自動氧化反應(yīng)速度的物質(zhì)，主要用于橡膠、塑料等加工工業(yè)，也作為油脂抗氧劑使用。

6、近年來，國外不少學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，BHT對肺、肝等組織有直接損害作用，并有促進(jìn)腫瘤發(fā)生的可能4，5，故建立注射用頭孢曲松鈉中抗氧劑BHT含量的測定方法，對控制產(chǎn)品的質(zhì)量非常必要。    本文旨在建立一種測定注射用頭孢曲松鈉樣品中抗氧劑BHT含量的HPLC方法，為進(jìn)一步研究丁基膠塞與藥物的相容性奠定了基礎(chǔ)，國內(nèi)外未見報道。    1  儀器與試藥    Waters 2690 HPLC系統(tǒng)(Waters 996 Photodiode Array Detector)；BHT從Sigma公司購買。注射用頭

7、孢曲松鈉的樣品來源：樣品1：注射用頭孢曲松鈉(批號04072614)由山東瑞陽制藥有限公司提供；樣品2：注射用頭孢曲松鈉(批號020228)由珠海聯(lián)邦制藥廠有限公司提供；樣品3：注射用頭孢曲松鈉(批號000124)由中外合資通化茂祥制藥有限公司提供；樣品4：注射用頭孢曲松鈉(批號000301)由重慶藥友制藥有限公司提供；樣品5：注射用頭孢曲松鈉(批號000303)由昆明積大制藥有限公司提供；樣品6：注射用頭孢曲松鈉(批號20000402)由中日合資哈爾濱博利爾藥業(yè)有限公司提供。乙腈為色譜純試劑，丙酮為國產(chǎn)分析純，水為高純水。    2  方法 

8、   2.1  樣品溶液的配制    取整瓶樣品(標(biāo)示量1.0g/瓶)置20ml頂空瓶中，加入10ml丙酮，用超聲波超聲5min，配制成100mg/ml的頭孢曲松鈉混懸液，靜置后，取上清液用有機(jī)濾膜過濾后，取20l濾液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。    2.2  色譜條件    色譜柱：Alltima C18(4.6mm×250mm，5m)；流動相：乙腈水(7723)；流速1.0ml/min；柱溫為室溫，檢測波長208nm；樣品濃度100mg/ml；進(jìn)樣體

9、積20l。    3  結(jié)果與討論    3.1  方法學(xué)考察    (1)線性考察  精密稱取BHT 10.8mg，置于50ml容量瓶中，用丙酮溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取1ml置50ml容量瓶中，用丙酮稀釋至刻度，搖勻，配制成濃度為4.32g/ml的溶液。依次吸取0.5、1.0、2.5和5.0ml至10ml的容量瓶中，加丙酮稀釋至刻度，搖勻，分別配制成濃度為0.216、0.432、1.08和2.16g/ml的溶液，分別取各溶液20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。百事通&

10、#160;   以進(jìn)樣濃度對峰面積回歸，得回歸方程：    A=157.56C+1.2733  r2=0.9999    說明BHT在0.2164.32g/ml的濃度范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣濃度呈良好的線性。    (2)精密度考察  取濃度為1.4g/ml的BHT的對照品溶液重復(fù)進(jìn)樣5針，主峰峰面積的RSD為0.58%，可見方法的精密度良好。    (3)最低檢出限和最低定量限考察  以信噪比為31計(jì)算最低檢出限為0.4ng；以

11、信噪比101計(jì)算最低定量限為1.3ng。    (4)溶液的穩(wěn)定性考察  取含量測定項(xiàng)下的樣品溶液，將溶液在室溫條件下放置0、4、8和24h后，分別進(jìn)樣20l，記錄色譜圖，計(jì)算主峰峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)為1.05%，說明溶液在24h內(nèi)保持穩(wěn)定，可保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。    (5)回收率考察  注射用頭孢曲松鈉樣品(批號020228，由珠海聯(lián)邦制藥廠有限公司提供)中沒有能夠檢出抗氧劑BHT，所以將此批樣品作為空白樣品，進(jìn)行加樣回收率考察。    取整瓶注射用頭孢曲松鈉樣品，分

12、別加入濃度為6.68g/ml的BHT對照溶液0.5、2.0和5.0ml，每個體積各兩份，然后分別加9.5、8.0和5.0ml丙酮，用超聲波超聲5min，充分搖勻，使成混懸液。靜置后取上清液，用有機(jī)濾膜過濾，取20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖，并計(jì)算回收率(圖1和表1)。    3.2  樣品測定結(jié)果    樣品溶液的配制方法同2.1，每批樣品取5瓶同時測定。    從測定的結(jié)果可以看出，所測定的6批樣品中有兩批樣品沒有檢測到抗氧劑BHT，其它4批樣品均檢出了一定量的抗氧劑BHT，但是不同批次的樣

13、品之間所含抗氧劑BHT的差別比較明顯(表2)。表2  不同批次樣品中所含抗氧劑BHT的含量測定結(jié)果    3.3  討論    (1)溶解樣品的溶劑選擇  頭孢曲松鈉本身能溶于水，抗氧劑BHT則不溶于水。所以測定樣品中的抗氧劑BHT應(yīng)選擇有機(jī)溶劑溶解樣品，使樣品中的抗氧劑BHT充分溶解；而頭孢曲松鈉不溶解，減少了頭孢曲松鈉對樣品中抗氧劑BHT測定的干擾。    選擇乙醇和丙酮兩種有機(jī)溶劑進(jìn)行考察。取整瓶樣品(每瓶1.0g)置20ml頂空瓶中，分別加入10ml無水乙醇和丙酮，用

14、超聲波超聲5min，配制成100mg/ml的頭孢曲松鈉混懸液，靜置后取上清液用有機(jī)濾膜過濾后，取20l續(xù)濾液注入液相色譜儀，記錄色譜圖。發(fā)現(xiàn)用兩種有機(jī)溶劑溶解樣品，所得到的抗氧劑的峰面積沒有明顯差異，但用無水乙醇溶解樣品的色譜圖中，頭孢曲松鈉的色譜峰比較明顯，而且由于配制的濃度比較大，造成色譜柱超載，對色譜柱有一定的損害；在采用丙酮溶解樣品的色譜圖中，基本沒有出現(xiàn)頭孢曲松鈉的色譜峰，最終選擇丙酮作為溶解樣品的有機(jī)溶劑。    (2)檢測波長的選擇  從抗氧劑BHT的紫外吸收光譜圖中可以看出(圖略)，抗氧劑BHT在200400nm的波長范圍內(nèi)存在兩個吸收峰

15、，分別在208和276nm處。由于注射用頭孢曲松鈉樣品中所含有的抗氧劑BHT的量均比較少，為達(dá)到較高的檢測靈敏度，我們選擇208nm作為抗氧劑BHT的檢測波長。    (3)色譜條件的選擇  有些樣品溶液的色譜圖中(圖略)抗氧劑BHT前有一相鄰雜質(zhì)峰，與抗氧劑BHT較難分離。在用乙腈水(7921)作為流動相時，抗氧劑BHT與相鄰雜質(zhì)則不能很好分離；改用乙腈水(7723)作為流動相時，兩者可以很好分離。    (4)樣品測定的均勻度  在測定樣品的過程中，每批樣品均取5瓶樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，除了一批樣品所含的抗氧

16、劑BHT的量較高，5份樣品測定結(jié)果的RSD小于2.0%外，其它三批樣品的RSD均較大，在10.0%左右。除了樣品中所含有的抗氧劑BHT比較微量的原因外，主要是因?yàn)闃悠分械目寡鮿〣HT均來自藥品包裝所用的藥用丁基膠塞，不同的樣品與膠塞的接觸時間、面積都在貯存過程中存在一定的不同，同時每瓶樣品所用的丁基膠塞也存在一定的差異，對樣品的測定結(jié)果也會帶來一定的影響。    (5)GC-FID法測定的問題  曾利用GC-FID的色譜條件測定注射用頭孢曲松鈉中含有的抗氧劑BHT，方法是將注射用頭孢曲松鈉樣品配制成100mg/ml的水溶液，頂空條件為80頂空30min。

17、但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)存在如下主要問題：對照溶液的配制。由于抗氧劑BHT對照試劑本身不溶于水，所以無法用水配制對照溶液。實(shí)驗(yàn)中，曾嘗試先用丙酮配制一定濃度的對照溶液，然后取少量對照溶液置20ml頂空瓶中，將丙酮在室溫條件下?lián)]發(fā)，然后加2ml水，將頂空瓶密封后頂空加熱進(jìn)樣，但重現(xiàn)性不好；靈敏度較差。測定的最低檢出限在微克水平，由于樣品中含有的抗氧劑BHT相對比較少，所以方法的靈敏度不好，直接影響樣品中抗氧劑BHT的檢出。【參考文獻(xiàn)】  1 涂林，余方鍵，胡昌勤. 國產(chǎn)注射用頭孢曲松鈉的質(zhì)量現(xiàn)狀J. 中國藥事，2002，16(1)：4546.2 肖全英，雪芳，曾環(huán)想，等. 注射用頭孢曲松鈉的膠塞相容性研究J. 廣東藥學(xué)院學(xué)報，2004，20(6)：610611.3 Zhao X, Jin S H, Hu C Q. The effect of rubber closures on the haze state of ceftriaxone sodium for injection J. Drug Dev Ind Pharm,2007,33(1):3544.4 Kehrer J P. Bleomycin and cyclopho