第9章 目的基因的獲取

1、 目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云目前被較廣泛提取使用的目的基因有：蘇云金桿菌金桿菌抗蟲基因抗蟲基因、人、人胰島素基因胰島素基因、人、人干擾素基干擾素基因因、種子、種子貯藏蛋白基因貯藏蛋白基因、植物、植物抗病基因抗病基因等。等。目的基因：目的基因：人們所需要研究的基因。人們所需要研究的基因。目的基因 1 1、概念、概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段2 2、原理：、原理：DNADNA復(fù)制復(fù)制1、利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因DNADNA擴(kuò)增擴(kuò)增儀儀四種脫氧核苷酸

2、四種脫氧核苷酸 一對引物一對引物：耐熱的耐熱的DNADNA聚合酶聚合酶(Taq(Taq酶）酶）模板模板DNA( DNA( 需含有目的基因需含有目的基因 ) ) 3 3、條件：、條件：一對一對寡寡核苷酸序列：核苷酸序列：與目的基與目的基因的起始段互補(bǔ)因的起始段互補(bǔ)。一段已知目的基因的核苷酸序列，以便一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根據(jù)這一序列合成引物根據(jù)這一序列合成引物4 4、前提：、前提：能量能量 5 5、過程、過程高溫變性高溫變性（解旋為單鏈解旋為單鏈）低溫退火低溫退火（引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合）適溫延伸適溫延伸（在在TaqTaq酶的作用下合成酶的作用下合成 與模板互補(bǔ)的與模板

3、互補(bǔ)的DNADNA雙鏈雙鏈）重復(fù)循環(huán)重復(fù)循環(huán)預(yù)變性（預(yù)變性（增加增加DNADNA變性的概率變性的概率）引物引物脫氧脫氧核苷核苷酸酸5 5、具體過程、具體過程 概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項，是一項 在生物在生物_復(fù)制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：_、 、 _、_ _ 、 _._.等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n n為擴(kuò)增為擴(kuò)增循循 環(huán)的次數(shù)）環(huán)的次數(shù)）結(jié)果：結(jié)果：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA復(fù)制復(fù)制四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物DNADNA聚合酶聚合酶指數(shù)指數(shù)2 2

4、n n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增模板模板DNADNA（含目的基因）（含目的基因）ATPATP過程：過程：a a、DNADNA變性變性（90-9590-95）：雙鏈）：雙鏈DNADNA模板模板 在熱作用下，在熱作用下，_斷裂，形成斷裂，形成_b b、退火、退火（復(fù)性復(fù)性55-6555-65）：系統(tǒng)溫度降低，引）：系統(tǒng)溫度降低，引 物與物與DNADNA模板結(jié)合，形成局部模板結(jié)合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的合成與模板互補(bǔ)的_。 氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNADNA

5、雙鏈雙鏈DNADNA鏈鏈PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增與技術(shù)擴(kuò)增與DNADNA復(fù)制的比較復(fù)制的比較堿基互補(bǔ)配對堿基互補(bǔ)配對四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNADNA在高溫下在高溫下變性解旋變性解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復(fù)制體外復(fù)制細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNADNA聚合酶聚合酶 細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)的DNADNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNADNA片段片段形成整個形成整個DNADNA分子分子基因文庫的構(gòu)建及目的基因的篩選基因文庫的構(gòu)建及目的基因的篩選基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建基因組文庫的構(gòu)建（6）從）從cDNA文庫中篩選目的基因文庫中篩選目的基因未知序列目的基因的篩選未知序列目的基因的篩選未知序列目的