幾丁質(zhì)酶抑制化合物產(chǎn)生菌的篩選初探

1、    幾丁質(zhì)酶抑制化合物產(chǎn)生菌的篩選初探            作者：時(shí)間：2007-11-22 11:03:00                            

2、;       作者：謝潔周澤揚(yáng)張新軍 藍(lán)希鉗 胡軍華【關(guān)鍵詞】  幾丁質(zhì)酶；,抑制化合物；,產(chǎn)生菌       摘要： 從采自全國(guó)的200多份土樣中分離出1350多株菌，利用平板透明圈法和鐵氰化鉀方法，以家蠶中腸幾丁質(zhì)酶作為靶標(biāo)，從這些菌株中篩選出家蠶幾丁質(zhì)酶抑制化合物的產(chǎn)生菌1237#，經(jīng)初步鑒定該菌株為假單胞菌。本文主要介紹幾丁質(zhì)酶抑制化合物篩選體系的建立、活性物質(zhì)性質(zhì)的初步探索及目的菌株的鑒定。關(guān)鍵詞： 幾丁質(zhì)酶； 抑制化合物； 產(chǎn)生菌  

3、;  Preliminary screening of chitinase inhibitor producing strains       ABSTRACT In the course of screening for new chitinase inhibitor, using the silkworm chitinase as a target, and transparent inhibition zone plate assay and potassium ferricyanide method, a strai

4、n belonging to the Pseudomonas, named#1237 was isolated among 1350 strains from 200 soil samples. The screening procedure and the preliminary study of the culture were also reported.KEY WORDS Chitinase; Inhibitor; Producingstrain   幾丁質(zhì)是甲殼類動(dòng)物、昆蟲外骨骼和真菌細(xì)胞壁的重要組成成分，它是N乙酰葡萄糖胺以1，4鍵連接起來(lái)的直鏈多聚物

5、。幾丁質(zhì)在自然界中的存在量?jī)H次于纖維素位居第二。幾丁質(zhì)酶是一類能把幾丁質(zhì)降解為N乙酰胺基葡萄糖或寡聚N乙酰胺基葡萄糖的水解酶。真菌需要幾丁質(zhì)酶降解子母細(xì)胞之間的隔以完成其生殖過(guò)程；昆蟲發(fā)育過(guò)程中也需要幾丁質(zhì)酶部分降解外骨骼以完成其變態(tài)發(fā)育的過(guò)程，因此在真菌生殖階段和昆蟲蛻皮階段其體內(nèi)幾丁質(zhì)酶的活性顯著增高。由于幾丁質(zhì)酶在真菌出芽生殖和昆蟲蛻皮過(guò)程中發(fā)揮了極為重要的作用，這就使得幾丁質(zhì)酶可能成為生物殺蟲劑和抗真菌藥物專一性作用的靶目標(biāo)。同時(shí)由于哺乳動(dòng)物不以幾丁質(zhì)代謝作為生命活動(dòng)必需系統(tǒng)1，故以幾丁質(zhì)酶作為靶目標(biāo)的生物殺蟲劑和抗真菌藥物具有對(duì)人畜無(wú)害的優(yōu)點(diǎn)。至今已報(bào)道的幾丁質(zhì)酶抑制劑主要有：All

6、osamidin2、 Argifin3、Argadin3、Demetyallosamidin4等。長(zhǎng)期以來(lái)日本等國(guó)一直在進(jìn)行幾丁質(zhì)酶抑制化合物的研究，但國(guó)內(nèi)至今未見與幾丁質(zhì)酶抑制化合物相關(guān)的研究報(bào)告。本研究旨在從我國(guó)豐富的微生物資源中獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型幾丁質(zhì)酶抑制化合物及其生產(chǎn)菌株，為開發(fā)具有新型作用點(diǎn)的殺蟲抗真菌藥物奠定基礎(chǔ)。    1 材料與方法    1.1 培養(yǎng)基    1.1.1 平板培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基。    1.1.2 液體培養(yǎng)基(%) 葡萄糖1，蛋白

7、胨02，牛肉膏01，酵母提取物01，F(xiàn)e2(SO4)3 0001，pH72。    1.1.3 幾丁質(zhì)酶抑制化合物的篩選平板(%) MgSO4 005，KH2PO4 005，KCl 005，F(xiàn)eSO47H2O 001，ZnSO47H2O 01，膠體幾丁質(zhì)1，瓊脂粉12，pH72。    1.2 幾丁質(zhì)酶粗酶 提取家蠶初蛹中腸液，經(jīng)硫酸銨鹽析、透析后凍干保存?zhèn)溆?；幾丁質(zhì)由日本信州大學(xué)下板誠(chéng)教授贈(zèng)送；膠體幾丁質(zhì)：利用鹽酸處理幾丁質(zhì)制備5。    1.3 活性菌株的液體培養(yǎng)方法菌體接種于液體培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)

8、6d，培養(yǎng)液8000r/min離心10min，取上清檢測(cè)活性。    1.4 幾丁質(zhì)酶抑制物的檢測(cè)方法    1.4.1 平板透明圈法 將幾丁質(zhì)粗酶配成01g/ml的幾丁質(zhì)粗酶液(以后提到的酶液均是按此法配成)，把酶液與篩選菌株培養(yǎng)液按12的比例混合，在幾丁質(zhì)酶抑制化合物篩選平板上打孔，取混合液50l加樣于孔中，觀察平板透明圈的大小。在檢測(cè)過(guò)程中以蒸餾水、緩沖液和液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。幾丁質(zhì)酶抑制化合物篩選平板含有膠體幾丁質(zhì)和無(wú)機(jī)鹽。在平板上打孔加入酶液，幾丁質(zhì)酶能分解平板中的膠體幾丁質(zhì)而產(chǎn)生透明圈。用相同量的酶液與檢測(cè)液混合時(shí)，透

9、明圈變小表明酶的活性受到抑制，透明圈越小表明受抑制的程度越高。這種方法能夠直觀、快捷地篩選出幾丁質(zhì)酶抑制化合物。    1.4.2 鐵氰化鉀方法7500l膠體幾丁質(zhì)加入100l酶液、不同測(cè)試培養(yǎng)液或?qū)φ找汉蚿H72磷酸鹽緩沖液(測(cè)試液體與緩沖液總體積為1000l)，37反應(yīng)30min，加入2ml糖顯色液，沸水浴15min終止反應(yīng)，離心，冷卻后測(cè)上清的A420(糖顯色液用05mol/L的Na2CO3配制成137 mol/L的鐵氰化鉀溶液)。測(cè)試組1 500l膠體幾丁質(zhì)加入100l酶液和1000l pH72磷酸鹽緩沖液，在37進(jìn)行正常酶促反應(yīng)30min后進(jìn)行測(cè)定。對(duì)照

10、1(C1) 500l膠體幾丁質(zhì)加入100l酶液和1000l pH72磷酸鹽緩沖液，加樣后立即沸水浴15min滅活酶，再置于37保溫30min和其他組一起測(cè)定。測(cè)試組2 500l膠體幾丁質(zhì)加入100l酶液、100l培養(yǎng)液和900l pH72磷酸鹽緩沖液，在37進(jìn)行正常酶促反應(yīng)30min后進(jìn)行測(cè)定。對(duì)照2(C2) 500l膠體幾丁質(zhì)加入100l酶液、100l培養(yǎng)液和900l pH72磷酸鹽緩沖液，加樣后立即滅活，再置于37保溫30min和其他組一起測(cè)定。測(cè)試組1與對(duì)照組1的吸光值的差值為Abs1，測(cè)試組2與對(duì)照組2的差值為Abs2。測(cè)定后按以下公式計(jì)算幾丁質(zhì)酶活性：酶活性(U/ml)=Abs

11、15;1000×1000 215.61×反應(yīng)時(shí)間(min)×反應(yīng)體系中酶液的體積(l)    1.5 1237#菌株產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶抑制化合物理化性質(zhì)初步探索    1.5.1 活性培養(yǎng)液的耐熱性檢測(cè) 耐熱性實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)了100、90、80、70、60、50、40等7個(gè)溫度梯度，均處理30min以后用平板透明圈法檢測(cè)其對(duì)幾丁質(zhì)酶的抑制活性。    1.5.2 幾丁質(zhì)酶抑制化合物的浸取或萃取 用甲醇、乙醇和水浸提等量1237#發(fā)酵液凍干粉中的幾丁質(zhì)酶抑制活性成分；用氯仿、乙酸乙酯萃

12、取等體積的1237#發(fā)酵液中的幾丁質(zhì)酶抑制活性成分。    1.5.3 有機(jī)溶劑沉淀幾丁質(zhì)酶抑制化合物 用丙酮、無(wú)水乙醇進(jìn)行活性發(fā)酵液的有機(jī)溶劑沉淀。    1.5.4 1237#具幾丁質(zhì)酶抑制活性的發(fā)酵液對(duì)淀粉酶活性的影響 使用平板透明圈法，用以淀粉和無(wú)機(jī)鹽作為基質(zhì)的檢測(cè)平板，檢測(cè)具幾丁質(zhì)酶抑制活性的1237#菌株發(fā)酵液對(duì)淀粉酶活性的影響。    1.6 幾丁質(zhì)酶抑制物產(chǎn)生菌的菌種鑒定7參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第八版)進(jìn)行菌種鑒定。2 結(jié)果    2.1 利用平板透明圈法初

13、步篩選出幾丁質(zhì)酶抑制物產(chǎn)生菌由于平板透明圈法篩選幾丁質(zhì)酶抑制物快捷、直觀，所以在粗篩的過(guò)程中采用此法。本研究從土壤中分離出的1000多株菌中篩選出菌株1237#，其代謝產(chǎn)物對(duì)家蠶幾丁質(zhì)酶具有很強(qiáng)的抑制活性(圖略)。    2.2 化學(xué)方法進(jìn)一步驗(yàn)證1237#對(duì)家蠶幾丁質(zhì)酶的抑制作用在利用平板透明圈法初步確定了假單胞菌1237#代謝產(chǎn)物對(duì)家蠶幾丁質(zhì)酶活性的抑制作用的基礎(chǔ)上，我們利用化學(xué)方法進(jìn)一步確定了該菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)家蠶幾丁質(zhì)酶的抑制活性。進(jìn)行三次重復(fù)，其Abs如圖1所示。從幾丁質(zhì)酶活力的計(jì)算公式中，我們可以看出，在其它條件都不變的情況下，酶活性的強(qiáng)弱取決于Abs

14、的大小。分析幾組數(shù)據(jù)，得出在加入1237#菌株的培養(yǎng)液后，家蠶幾丁質(zhì)酶的活性被抑制了513%?；瘜W(xué)方法進(jìn)一步確定了該菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物中含有對(duì)幾丁質(zhì)酶活性具有抑制作用的物質(zhì)。 1：正常情況下的Abs； 2：加入具幾丁質(zhì)酶抑制活性的發(fā)酵液后的Abs 圖1 假單胞菌123#次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)家蠶 幾丁質(zhì)酶的抑制作用    2.3 幾丁質(zhì)酶抑制化合物理化性質(zhì)的初步探索    2.3.1 幾丁質(zhì)酶抑制化合物的耐熱性 研究表明菌株1237#產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶抑制物耐熱性較差，在60處理30min將完全喪失幾丁質(zhì)酶抑制活性；50處理30min也使幾丁質(zhì)酶抑

15、制活性部分喪失；但在40以下保溫?cái)?shù)天對(duì)幾丁質(zhì)酶抑制活性無(wú)影響。    2.3.2 幾丁質(zhì)酶抑制化合物的浸提或萃取 用甲醇、乙醇和水來(lái)浸提等量的活性發(fā)酵液凍干樣品中的幾丁質(zhì)酶抑制活性組分時(shí)，僅僅只有水能將凍干樣品中的幾丁質(zhì)酶抑制活性組分溶    解提出，甲醇和乙醇不能將其浸提出；若將甲醇和乙醇浸提后的不溶物用水溶解后檢測(cè)其具有幾丁質(zhì)酶抑制活性。用氯仿進(jìn)行液液萃取時(shí)，萃取結(jié)束后水相和氯仿中均檢測(cè)不出幾丁質(zhì)酶抑制活性，提示活性物質(zhì)被破壞；用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，活性物質(zhì)仍留在水相中。    2.3.3 有

16、機(jī)溶劑沉淀 丙酮和無(wú)水乙醇均能將1237#菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物中的幾丁質(zhì)酶抑制活性成分沉淀出，但使用相同體積的有機(jī)溶劑時(shí)，丙酮沉淀得到的活性物質(zhì)的量更多。    2.3.4 1237#具幾丁質(zhì)酶抑制活性的發(fā)酵液對(duì)淀粉酶活性的影響 該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，1237#菌株代謝產(chǎn)物對(duì)淀粉酶的活性不會(huì)產(chǎn)生任何影響，這在一定程度上說(shuō)明1237#菌株代謝產(chǎn)物中含有幾丁質(zhì)酶的特異性抑制化合物。    2.4 幾丁質(zhì)酶抑制物產(chǎn)生菌的分離、純化、鑒定從全國(guó)采集的300多份土樣中分離出1000多株菌，這些菌主要是細(xì)菌和真菌。從這批菌種中我們篩選到幾丁質(zhì)酶抑制物的產(chǎn)生

17、菌1237#，根據(jù)其菌落形態(tài)和菌體形態(tài)，參照伯杰氏細(xì)菌鑒定守則鑒定該菌株為假單胞菌，部分性質(zhì)見表1。表1 1237#菌株部分性質(zhì)檢測(cè)項(xiàng)目 結(jié)果 檢測(cè)項(xiàng)目 結(jié) 果 革蘭染色 陰性 直徑/長(zhǎng) 0.5m/2m氧化酶反應(yīng) 陽(yáng)性 明膠水解反應(yīng) 陽(yáng)性接觸酶反應(yīng) 陽(yáng)性 生長(zhǎng)溫度影響 最適溫度：37；4不 生長(zhǎng)，41能生長(zhǎng)    3 小結(jié)本研究在建立簡(jiǎn)便、快速幾丁質(zhì)酶抑制化合物的檢測(cè)方法(平板透明圈法)的基礎(chǔ)上，從土壤中篩選到假單孢菌1237#。該菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物中含有幾丁質(zhì)酶抑制化合物。在對(duì)該幾丁質(zhì)酶抑制化合物性質(zhì)初步探索的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)不能耐受較高溫度，60處理30min

18、喪失幾丁質(zhì)酶抑制活性；活性物質(zhì)是極性很強(qiáng)的水溶性化合物，乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯均不能將其萃取出來(lái)，同時(shí)氯仿對(duì)幾丁質(zhì)酶抑制化合物的活性具有極大的破壞作用，用氯仿萃取活性將完全喪失。從以上的研究結(jié)果可以初步推斷假單胞菌1237#次級(jí)代謝產(chǎn)物中的幾丁質(zhì)酶抑制化合物可能是蛋白質(zhì)或者肽類物質(zhì)。此外，該幾丁質(zhì)酶抑制活性物質(zhì)不會(huì)對(duì)淀粉酶的活性產(chǎn)生任何影響。關(guān)于該物質(zhì)的純化和其相關(guān)基因的克隆工作尚在進(jìn)行中。    參考文獻(xiàn)    1 Boot R G, Renkema G H, Verhoek M, et al . The human chito

19、triosidase gene: nature of inherited enzyme deficiency J. J Biol Chem ,1998,273:25680    2 Sakuda S, Isogai A, Matsumoto S, et al . Search for microbial insect growth regulators II. Allosamidin, a novel insect chitinase inhibitor J. J Antibiot (Tokyo) ,1987,40(3):296    3 Houston D R, Shiomi K, Arai N, et al . Highresolution structures of a chitinase complexed with natural product cyclopentapeptide inhibitors: Mimicry of carbohydrate subst