山茱萸藥材指紋圖譜的研究

1、西北植物學(xué)報2004,24(10:19221928A ctaB ot.B orea l.-O cciden t.S in.文章編號:100024025(20041021922207山茱萸藥材指紋圖譜的研究王花紅1,郭五保2,顧瑩2,王吉吉之13(1陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西安710062;2陜西中醫(yī)藥研究院實驗中心,西安710003摘要:以乙腈2磷酸梯度洗脫,用高效液相色譜法建立山茱萸藥材的指紋圖譜。用方法學(xué)考察,表明其精密度高,重現(xiàn)性好。實驗測定多批樣品圖譜,共確定10個共有指紋峰,采用相關(guān)系數(shù)法計算不同樣品指紋圖譜之間相似度,結(jié)果表明指紋圖譜相似度大小與藥材品質(zhì)有關(guān)。關(guān)鍵詞:山茱萸;指紋

2、圖譜;高效液相色譜中圖分類號:Q946.91;R917文獻(xiàn)標(biāo)識碼:AStud ies on f i ngerpr i n ts of M acroca rp ium of f icina leW AN G H ua2hong1,GUO W u2bao2,GU Y ing2,W AN G Zhe2zh i13(1Co llege of L ife Sciences,ShaanxiN o r m al U niversity,Shaanxi X ian710062,Ch ina;2Center of Experi m ent,ShaanxiA cade2 m y of T raditi onal

3、Ch inese M edicine,X ian710003,Ch inaAbstract:F ingerp rin ts of M acroca rp ium of f icina le w as estab lished by h igh perfo r m ance liqu id ch rom atogra2 p hy(H PL Cin the study.Gradien t m ob ile system w as app lied w ith aceton itrile2pho spho ric acid and the m ethodo logical exp eri m en

4、ts show ed h igh p recisi on and good rep eatab ility.T here are10comm on finger2 p rin t p eak s w ere iden tified after m any sam p les w ere deter m ined.T he si m ilarity am ong differen t sam p les w as com p ared by calcu lating co rrelati on coeffcien ts,w h ich w as co rrelated w ith the qua

5、lity of the herb. Key words:M acroca rp ium of f icina le(Sieb.et Zucc.N akai;fingerp rin ts;H PL C中藥山茱萸(FRU CTU S CORN I是山茱萸科(Co rnaceae山茱萸屬(M acroca rp ium植物山茱萸(M acroca rp ium of f icina le(Sieb.et Zucc.N akai的成熟干燥果肉,主產(chǎn)于我國陜西、浙江、河南等省,四川、安徽、山東、山西亦有栽培。山茱萸始載于神農(nóng)本草經(jīng),為我國傳統(tǒng)珍貴的中藥材,以除去種子的果肉入藥,味酸澀,性微溫,為收斂性強(qiáng)

6、壯藥,有補(bǔ)肝腎止汗的作用1。近代藥理學(xué)研究表明,山茱萸不僅能抗炎殺菌2,還具有較好的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能的作用35和顯著的降血糖作用6,對艾滋病及癌癥等也有一定的療效7,8,藥用價值較高,同時又是常用中成藥“六味地黃丸”、“桃豆地黃湯”等的原料,中藥生產(chǎn)用量和市場需求量大,具有廣闊的開發(fā)前景。目前國內(nèi)外對山茱萸的研究主要集中在其化學(xué)成分及藥理作用的研究,缺乏綜合評價和分析藥材品質(zhì)的方法和尺度,而山茱萸在長期的應(yīng)用和栽培的過程中,種內(nèi)產(chǎn)生很大變異,出現(xiàn)較多類型,同時因藥材多由藥農(nóng)自己加工、且加工方法不同,導(dǎo)致藥材質(zhì)量存在一定差異,造成目前藥源質(zhì)量不穩(wěn)定和市售藥材質(zhì)量無法正確評估的混亂局面。中藥材指紋

7、圖譜研究作為現(xiàn)代中藥質(zhì)量控制和鑒別的新興技收稿日期:2003206220;修改稿收到日期:2004209203基金項目:國家“十五”攻關(guān)項目(2001BA701A35;陜西省陜南中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室(2003;陜西漢江藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司資助作者簡介:王花紅(1979-,女(漢族?，F(xiàn)在中國科學(xué)院植物研究所攻讀博士,主要從事植物化學(xué)和分子生物學(xué)研究。術(shù),為質(zhì)量評價問題的解決提供了新的思路和方法。通過建立中藥材指紋圖譜可以全面反映中藥材所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類和數(shù)量,進(jìn)而反映中藥材的質(zhì)量,因而是中藥材的一種新型的且有意義生產(chǎn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究采用高效液相色譜法建立山茱萸藥材指紋圖譜,為山茱萸藥材

8、的綜合質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。1材料和方法1.1材料山茱萸(M acroca rp ium of f icina le(Sieb.et Zucc.N akai藥材分別從陜西、河南、浙江、山西、四川、安徽等地采集或收集,所測樣品詳見表1。表1山茱萸指紋圖譜研究樣品表T able1T he samp les of fingerp rints of M.of f icinale樣品號N o.of samp les產(chǎn)地P roducting area樣品號N o.of samp les產(chǎn)地P roducting area1陜西佛坪200113陜西佛坪20022陜西佛坪200214陜西佛坪20023陜西佛

9、坪200215陜西佛坪20024陜西佛坪200216陜西佛坪20025陜西佛坪200217陜西丹鳳20026陜西佛坪200318河南內(nèi)鄉(xiāng)20027陜西佛坪200319浙江臨安20028陜西佛坪200320山西陽城藥材公司購2002 9陜西佛坪200321安徽亳州藥材公司購2002 10陜西佛坪200322四川安縣藥材公司購2002 11陜西佛坪200223藥材市場商品200212陜西佛坪200224陜西隴縣藥材公司購20021.2方法1.2.1儀器與試劑儀器:w aters2690型高效液相色譜儀(四元泵,自動進(jìn)樣器,PDA檢測器,M il2 len ium32色譜工作站。試劑:甲醇色譜純美國

10、F ish ier試劑公司乙腈色譜純美國F ish ier試劑公司水純凈水甲醇,磷酸分析純標(biāo)準(zhǔn)品:熊果酸(U rso lic acid,74228701,中國藥品生物制品檢定所齊墩果酸(O leano lic acid,070929803中國藥品生物制品檢定所馬錢素(L ogan in,2423980Sigm a公司1.2.2色譜條件色譜柱:K rom asil C18色譜柱(4.6×250mm,5m及其C18保護(hù)柱;流動相:乙腈20.4%磷酸水溶液梯度洗脫,梯度見表2;柱溫:室溫;流速:1mL m in;檢測波長:210 nm;進(jìn)樣量:10L;1.2.3標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱取熊果

11、酸標(biāo)準(zhǔn)品3.9m g,置10mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得0.39m g mL熊果酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品3.2m g,置10mL容量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得0.32 m g mL齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液。表2指紋圖譜流動相線性梯度表T able2T he linearity of mobile system of fingerp rints 時間T i m e(m in乙腈A cetonitrile(%0.4%磷酸0.4%H3PO4精密稱取馬錢素標(biāo)準(zhǔn)品4.1m g,置10mL容量瓶中,用30%甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,即得0. 41m g mL馬錢素

12、標(biāo)準(zhǔn)儲備液。1.2.4樣品溶液的制備精密稱取山茱萸粗粉(40目1.00g,置25mL容量瓶中,加25mL甲醇,超聲處理30m in,取出,過濾,并用10mL甲醇清洗濾紙,合并濾液,置蒸發(fā)皿濃縮,轉(zhuǎn)移至5mL容量瓶中定容,過0.45m微孔濾膜后進(jìn)樣10L。2結(jié)果2.1空白試驗吸取甲醇10L,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果見圖1,表明空白無干擾。329110期王花紅,等:山茱萸藥材指紋圖譜的研究 圖1山茱萸指紋圖譜空白對照F ig .1B lank contro l of fingerp rints of M .of f icinale圖2山茱萸指紋圖譜馬錢素、熊果酸、齊墩果酸對照品H PL

13、 C 圖F ig .2L oganin ,OA ,UA standards of fingerp rints of M .of f icinale2.2對照試驗分別吸取各對照品溶液10L ,注入高效液相色譜儀,記錄色譜圖,見圖2。2.3圖譜測定時間的確定取樣品溶液,注入高效液相色譜儀,記錄120m in 色譜圖,結(jié)果表明100m in 后無有意義峰出現(xiàn),故確定圖譜記錄時間為100m in 。2.4精密度試驗取同一批山茱萸藥材,按1.2.4方法制備供試液,連續(xù)進(jìn)樣5次,測定圖譜,結(jié)果表明5次進(jìn)樣相對保留時間偏差在0.0020.051之間,5%總峰面積的各共有峰相對峰面積的R SD 在1.23%1

14、.94%之間,各共有峰相對峰面積及相對保留時間的R SD <3%,表明儀器的精密度良好。2.5重現(xiàn)性試驗取同一批山茱萸藥材,按1.2.4方法制備供試液樣品5份,分別檢測指紋圖譜,結(jié)果表明各共有峰相對保留時間偏差在0.0010.029之間,5%總峰面積的各共有峰相對峰面積的R SD 在0.36%2.81%之間,各共有峰相對峰面積及相對保留時間的R SD <3%,表明方法重現(xiàn)性良好。2.6穩(wěn)定性試驗取同一批山茱萸藥材,按1.2.4方法制備樣品溶液,分別在0h ,4h ,8h ,12h ,24h 檢測指紋圖譜,結(jié)果表明各共有峰相對保留時間標(biāo)準(zhǔn)偏差分別在0.0040.048之間,5%總峰面

15、積的各共有峰相對峰面積的R SD 在1.11%2.51%之間。各共有峰相對峰面積及相對保留時間的R SD <3%,表明樣品溶液在24h 內(nèi)穩(wěn)定。4291西北植物學(xué)報24卷2.7HPLC 指紋圖譜及技術(shù)參數(shù)2.7.1指紋圖譜及各共有峰的標(biāo)定對不同樣品進(jìn)行測定,記錄100m in 色譜圖,圖3。比較不同樣品的色譜圖,同時對各色譜峰的紫外光譜圖進(jìn)行比較,色譜圖中可察見的峰有20多個,構(gòu)成指紋特征的峰有17個,將圖譜分為4個指紋區(qū),分別為 區(qū),R T 為1025m in ,有5個峰; 區(qū),R T 為4055m in ,有5個峰; 區(qū),R T 為6575m in ,有5個峰; 區(qū),R T 為901

16、00m in ,有2個峰,見圖3、4。其中對照品馬錢素分布在 區(qū),熊果酸和齊墩果酸分布在 區(qū)。多批樣品圖譜中有10個色譜峰為其共有的,因此確定為共有指紋峰。經(jīng)與對照品比較,鑒定其中3個峰,分別為馬錢素(峰5、齊墩果酸(峰9、熊果酸(峰10,見圖24 。圖3山茱萸H PL C 指紋圖譜F ig .3F ingerp rints of M .of f icinale圖4示山茱萸指紋圖譜指紋 、 區(qū)F ig .4Show the rigi on 、of F ingerp rints of M .of f icinale 2.7.2指紋圖譜技術(shù)參數(shù)根據(jù)中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行,以參照物峰

17、(S 的相對保留時間和相對峰面積為1,計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。馬錢素為山茱萸中主要有效成分,且其峰面積在圖譜中相對較大,保留時間適中,故選擇馬錢素為參考峰(S 1,以其保留時間和峰面積值為1,計算各樣品共有峰的相對保留時間和相對峰面積。按樣品制備方法制備樣品溶液,測定23批樣品圖譜,共有峰相對保留時間和相對峰面積見表3、圖4,圖5。由表3、4可得出,23批樣品中10個共有峰的相對保留時間為:1(0.349±0.003,2(0.419±0.004,3(0.956±0.002,4(0.979±0.001,5(S 1(1,6(1.024

18、7;0.004,7(1.476±0.004,8(1.489±0.003,9(S 2(2.003±0.006,10(S 3529110期王花紅,等:山茱萸藥材指紋圖譜的研究(2.018±0.007,相對峰面積為:1(0.774±0.327,2(5.641±1.444,3(1.259±0.642,4(0.259±0.087,5(S 1(1.000,6(0.742±0.343,7(0.668±0.247,8(1.168±0.566,9(S 2(0.152±0.056,10(S 3(

19、0.409±0.140。根據(jù)23批樣品的相對保留時間及指紋圖譜的 。圖5山茱萸樣品H PL C 圖譜F ig .5T he fingerp rints of M .of f icinale表3山茱萸指紋圖譜共有峰相對保留時間結(jié)果T able 3R esults of RR T of common peak in fingerp rints of M .of f icinale峰號N o .peak6291西北植物學(xué)報24卷10 期 王花紅, 等: 山茱萸藥材指紋圖譜的研究 表 4山茱萸指紋圖譜共有峰相對峰面積結(jié)果 T ab le 4R esu lts of RA of comm on

20、 p eak in fingerp rin ts of M . of f icina le 1927 峰號 N o. p eak 1 1. 563 0. 619 0. 661 0. 985 0. 861 1. 001 0. 566 0. 539 0. 360 0. 426 0. 959 0. 338 0. 833 1. 020 1. 103 0. 552 1. 787 1. 540 2. 000 1. 438 1. 610 1. 212 0. 844 2 2. 747 6. 581 5. 185 4. 279 6. 242 6. 213 6. 445 5. 037 4. 847 5. 300

21、6. 682 2. 968 5. 860 7. 599 7. 810 6. 466 3. 576 6. 154 8. 782 3. 427 6. 818 3. 484 2. 741 3 0. 772 1. 225 0. 626 0. 508 1. 123 1. 902 1. 265 0. 726 0. 774 1. 402 1. 940 0. 451 2. 043 1. 750 0. 979 2. 656 1. 148 1. 836 6. 376 1. 828 0. 861 1. 502 0. 735 4 0. 246 0. 216 0. 225 0. 214 0. 343 0. 217 0.

22、 260 0. 142 0. 169 0. 186 0. 302 0. 275 0. 239 0. 380 0. 492 0. 235 0. 147 0. 318 0. 266 0. 221 0. 281 0. 250 0. 192 5 ( S1 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 6 0. 430 0. 354

23、 0. 775 0. 357 1. 206 0. 581 1. 474 0. 607 0. 978 0. 664 0. 951 0. 510 0. 440 1. 170 0. 943 0. 433 0. 755 0. 747 0. 492 0. 539 0. 387 0. 340 0. 501 7 0. 361 0. 800 0. 687 0. 401 0. 750 0. 373 0. 835 0. 722 0. 832 0. 737 0. 942 0. 332 0. 431 1. 103 0. 955 0. 424 0. 313 0. 680 1. 900 1. 466 0. 395 0.

24、205 0. 439 8 1. 511 0. 110 1. 132 0. 138 1. 776 1. 168 1. 728 0. 988 1. 006 1. 470 1. 859 0. 615 0. 848 1. 949 1. 493 0. 898 1. 288 1. 790 0. 569 0. 173 0. 800 1. 102 1. 403 9 ( S2 0. 122 0. 129 0. 155 0. 129 0. 205 0. 114 0. 214 0. 115 0. 139 0. 154 0. 153 0. 092 0. 106 0. 198 0. 308 0. 101 0. 115

25、0. 194 0. 177 0. 109 0. 110 0. 089 0. 092 10 ( S3 0. 324 0. 386 0. 454 0. 368 0. 599 0. 282 0. 582 0. 311 0. 388 0. 354 0. 397 0. 243 0. 285 0. 527 0. 751 0. 289 0. 327 0. 510 0. 527 0. 312 0. 283 0. 235 0. 259 樣1 樣2 樣3 樣4 樣5 樣6 樣7 樣8 樣9 樣 10 樣 11 樣 12 樣 13 樣 14 樣 15 樣 16 樣 17 樣 18 樣 19 樣 20 樣 21 樣

26、22 樣 23 表 5山茱萸指紋圖譜相似度計算結(jié)果 T ab le 5R esu lts of si ila rity of fingerp rin ts of M . of f icina le m 樣品號 Sam p les 1 0. 876 13 0. 984 2 0. 983 14 0. 994 3 0. 991 15 0. 992 4 0. 972 16 0. 967 5 0. 998 17 0. 929 6 0. 992 18 0. 989 7 0. 981 19 0. 849 8 0. 994 20 0. 868 9 0. 983 21 0. 988 10 0. 989 22 0

27、. 950 11 0. 991 23 0. 939 12 0. 975 相似度 Sim ilarity 樣品號 Sam p les 相似度 Sim ilarity 平均相似度 A verage of sim ilarity 0. 964 3討論 3. 1流動相的選擇 含五環(huán)三萜酸和環(huán)烯醚萜甙類等成分的光譜圖選擇 檢測波長。 由于五環(huán)三萜類成分多為端吸收類物質(zhì), 最大吸收均在 200 nm 左右處, 環(huán)烯醚萜甙類成分 最大吸收在 230 nm 左右。試驗表明在 230 nm 處圖 譜信息量少, 不足以顯示指紋特征, 所以為兼顧兩類 成分均能有較高檢測響應(yīng)值, 實驗選取 210 nm 為 實際檢測

28、波長, 得到色譜峰數(shù)目適中、 分離度較好的 圖譜。 3. 3對照品的選擇 實驗過程中選擇了多種流動相系統(tǒng): ( 1 甲醇2 水梯度洗脫; ( 2 甲醇20. 4% 磷酸梯度洗脫; ( 3 乙腈 2水梯度洗脫; ( 4 乙腈20. 4% 磷酸梯度洗脫。結(jié)果表 乙腈相對較好, 故實驗選取 ( 4 號系統(tǒng)為流動相。 3. 2檢測波長的選擇 明酸性環(huán)境有利于各色譜峰的分離, 而甲醇由于在 檢測波長處吸收較強(qiáng), 梯度洗脫時基線漂移嚴(yán)重, 而 馬錢素屬環(huán)烯醚萜甙類物質(zhì), 水溶性較強(qiáng), 為山 茱萸中有效成分, 而且含量較豐富, 在圖譜中出峰時 實驗采用二極管陣列檢測器, 結(jié)合山茱萸中所 © 199

29、4-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. 1928 西北植物學(xué)報 24 卷 間適中, 穩(wěn)定性、 分離度均較好, 故選為對照品之一; 熊果酸和齊墩果酸也是山茱萸 中 的 主 要 有 效 成 分 9, 10 計算結(jié)果表明除樣品 1、 、 相似度較低外, 其它 19 20 樣品相似度均在 0. 9 以上, 表現(xiàn)出良好的相似性。 而 所收集樣品中, 樣品 1 為 2001 年產(chǎn)藥材, 放置時間 較久, 可能導(dǎo)致藥材變質(zhì), 因而相似度較低; 樣品 19、 為 2002 年產(chǎn)的藥材公司收購

30、的藥材, 因保存 20 , 且能在圖譜中顯示, 故也選為對照品。 3. 4提取方法的選擇 實驗以盡可能多體現(xiàn)山茱萸中主要成分為原 則, 設(shè)計樣品溶液制備方法。 分別選取氯仿、 乙酸 苯、 乙酯、 正丁醇、 甲醇、 乙醇為提取溶媒, 并對提取物 H PL C 圖譜分析, 經(jīng)比較認(rèn)為醇提物圖譜信息比較 不當(dāng)已有霉變現(xiàn)象, 相似度也較低, 由此可見, 指紋 圖譜相似度評價標(biāo)準(zhǔn)與藥材品質(zhì)有較好的一致性; 而熊果酸含量測定結(jié)果表明樣 19、 均高于所測樣 20 品的平均值, 而樣 1 熊果酸含量也較低, 如果只考慮 其中熊果酸含量, 則樣 19、 都屬于較高質(zhì)量的藥 20 材, 這與藥材霉變現(xiàn)象不符。

31、因此, 本研究結(jié)果從一 定程度上表明指紋圖譜為更全面的藥材質(zhì)量控制手 段。 豐富, 既含脂溶性成分也包括水溶性部分, 符合指紋 圖譜整體性的要求, 能較好反應(yīng)藥材指紋特征, 故確 定甲醇作為山茱萸指紋圖譜的提取溶媒。 3. 5山茱萸指紋圖譜相似度評價 實驗分別測定 24 批樣品指紋圖譜, 相關(guān)系數(shù)法 致謝: 本文實驗中曾得到高錦明教授的指導(dǎo)。 參考文獻(xiàn): 1 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典 M . 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2000: 22. 2 DA I Y ( 戴岳 , HAN G B Q ( 杭秉茜 , HU AN G C L ( 黃朝林. A n ti2inflamm ato r

32、y effect of aqueou s ex tract of M acroca rp ium of f icina le J . Ch ina J ou rna l of Ch inese M a teria M ed ica ( 中國中藥雜志 , 1992, 17 (5 : 307 ( in Ch inese. na l of Ch ina P ha rm aceu tica l U n iversity ( 中國藥科大學(xué)學(xué)報 , 1990, 21 (4 : 226- 228 ( in Ch inese. nese T rad itiona l and H erba l D rug s

33、( 中草藥 , 1990, 21 (3 : 17- 20 ( in Ch inese. 3 DA I Y ( 戴岳 , HAN G B Q ( 杭秉茜 , HU AN G C L ( 黃朝林. Effect of M acroca rp ium of f icina le on im m uno reaction of m ou seJ . J ou r2 4 ZHAO W S ( 趙武述 , ZHAN G Y Q ( 張玉琴 , L I H ( 李浩. Stud ies on M acroca rp ium of f icina le and its im m uno log ical activitiesJ . Ch i2 5 ZHAO S P ( 趙世萍 , CH EN Y W ( 陳玉武 , GU O J Z ( 郭景珍. A n t