單抗制備詳細步驟11

1、摘 要單克隆抗體技術是現代生命科學研究的重要工具,在基因和蛋白質的結構和功能研究方面有著不可或缺的作用。近年來,隨著分子生物學技術的發(fā)展,出現了嵌合單克隆抗體和由轉基因小鼠、噬菌體展示技術、核糖體展示技術及共價展示技術所產生的單克隆抗體。這些技術將有效解決單克隆抗體的鼠源性等問題。本文主要講述制備單抗的實驗過程，并對實驗結果及其影響因素進行分析。關鍵詞：抗體，單克隆，腫瘤，細胞融合，淋巴細胞AbstractThe monoclonal antibody technology is the modern life sciences research important tool, has the

2、 indispensable function in the gene and the protein structure and the function research aspect. In recent years, along with the molecular biology technology's development, presented the embedment monoclonal antibody and by the transgene mouse, the bacteriophage demonstrated that the technology,

3、the ribosome demonstrated the technology and the covalence demonstrated the technology produces monoclonal antibody. These technologies effective addressing monoclonal antibody questions and so on mouse source. This article mainly prepares Shan Kang the new technology to the above several kinds to m

4、ake a summary and analysis of factors.Keywords:antibodi,monoclonal, neoplasms,cell fusion,lymphocyte單克隆抗體的制備1、單克隆抗體的概念抗體是機體在抗原刺激下產生的能與該抗原特異性結合的免疫球蛋白。常規(guī)的抗體制備是通過動物免疫并采集抗血清的方法產生的，因而抗血清通常含有針對其他無關抗原的抗體和血清中其他蛋白質成分。一般的抗原分子大多含有多個不同的抗原決定簇，所以常規(guī)抗體也是針對多個不同抗原決定簇抗體的混合物。即使是針對同一抗原決定簇的常規(guī)血清抗體，仍是由不同B細胞克隆產生的異質的抗體組成。因而，

5、常規(guī)血清抗體又稱多克隆抗體（polyclonal antibody），簡稱多抗。由于常規(guī)抗體的多克隆性質，加之不同批次的抗體制劑質量差異很大，使它在免疫化學試驗等使用中帶來許多麻煩。因此，制備針對預定抗原的特異性均質的且能保證無限量供應的抗體是免疫化學家長期夢寐以求的目標。隨著雜交瘤技術的誕生，這一目標得以實現。 1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴細胞雜交瘤技術，他們把用預定抗原免疫的小鼠脾細胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細胞融合，形成B細胞雜交瘤。這種雜交瘤細胞具有雙親細胞的特征，既像骨髓瘤細胞一樣在體外培養(yǎng)中能無限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴細胞那樣合成和分泌

6、特異性抗體。通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細胞的單克隆系，即雜交瘤細胞系，它所產生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質的抗體，即所謂單克隆抗體（monoclonal antibody），簡稱單抗。 與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復性好、且能持續(xù)地無限量供應。單抗技術的問世，不僅帶來了免疫學領域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學科學的各個領域獲得極廣泛的應用，促進了眾多學科的發(fā)展。Kohler和Milstein兩人由此杰出貢獻而榮獲1984年度諾貝爾生理學和醫(yī)學獎。2、雜交瘤技術2.1 雜交瘤技術的誕生淋巴細胞雜交瘤技術的誕生是幾十年來免疫學在理論和技術兩方面發(fā)展的必然結果，抗體生成的克隆選擇

7、學說、抗體基因的研究、抗體結構與生物合成以及其多樣性產生機制的揭示等，為雜交瘤技術提供了必要理論基礎，同時，骨髓瘤細胞的體外培養(yǎng)、細胞融合與雜交細胞的篩選等提供了技術貯備。1975年8月7日，Kohler和Milstein在英國自然雜志上發(fā)表了題為“分泌具有預定特異性抗體的融合細胞的持續(xù)培養(yǎng)”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名論文。他們大膽地把以前不同骨髓瘤細胞之間的融合延伸為將喪失合成次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（hypoxanthine guanosine

8、 phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤細胞與經綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合。融合由仙臺病毒介導，雜交細胞通過在含有次黃嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培養(yǎng)基（HAT）中生長進行選擇。在融合后的細胞群體里，盡管未融合的正常脾細胞和相互融合的脾細胞是HGPRT+，但不能連續(xù)培養(yǎng)，只能在培養(yǎng)基中存活幾天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤細胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤細胞不能在HAT培養(yǎng)基中存活，只有骨髓瘤細胞與脾細胞形成的雜交瘤細胞因得到分別來自親本脾細胞的HGPRT和親

9、本骨髓瘤細胞的連續(xù)繼代特性，而在HAT培養(yǎng)基中存活下來。實驗的結果完全像起始設計的那樣，最終得到了很多分泌抗綿羊紅細胞抗體的克隆化雜交瘤細胞系。用這些細胞系注射小鼠后能形成腫瘤，即所謂雜交瘤。生長雜交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同質的抗體，即單克隆抗體。    這一技術建立后不久，在融合劑和所用的骨髓瘤細胞系等方面即得到改進。最早仙臺病毒被用做融合劑，后來發(fā)現聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染問題，從而得到廣泛的應用。隨后建立的骨髓瘤細胞系如SP2/0-Ag14，X63-Ag8.653和NSO/1都是既不合成輕鏈又不合成重鏈的變種，所以由它們產生

10、的雜交瘤細胞系，只分泌一種針對預定的抗原的抗體分子，克服了骨髓瘤細胞MOPC-21等的不足。再后來又建立了大鼠、人和雞等用于細胞融合的骨髓瘤細胞系，但其基本原理和方法是一樣的。2.2 基本程序和方法  雜交瘤技術在具體操作上，各實驗室使用的程序不盡一致。本節(jié)中介紹的方法是作者所在實驗室采用的、實踐證明成熟的程序，該程序適合國內大多數實驗室。在開展雜交瘤技術制備單抗之前，培養(yǎng)骨髓瘤和雜交瘤細胞必須具備下列主要儀器設備：超凈工作臺、CO2恒溫培養(yǎng)箱、超低溫冰箱（-70）、倒置顯微鏡、精密天平或電子天平、液氮罐、離心機（水平轉子，4000r/min）、37水浴箱、純水裝置、濾器、真空泵等。

11、其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml細胞培養(yǎng)瓶，10ml、1ml刻度吸管，試管，滴管（彎頭、直頭），平皿，燒杯，500ml、250ml、100ml鹽水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔細胞培養(yǎng)板，融合管（50ml圓底帶蓋玻璃或塑料離心管），眼科剪刀，眼科鑷，血細胞計數板，可調微量加樣器（50ul，200ul，1000ul），彎頭針頭，200目篩網，小鼠固定裝置等。此外，雜交瘤細胞的篩選與檢測的儀器設備，依據檢測單抗的方法不同而各異，請參閱本節(jié)有關部分。淋巴細胞雜交瘤技術的主要步驟包括：動物免疫、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選與單抗檢測、雜交瘤細胞的克隆

12、化、凍存、單抗的鑒定等.2.2.1、動物免疫2.2.1.1 抗原制備 制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，應根據所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，抗原的來源有限，或性質不穩(wěn)定，提純時易變性，或其免疫原性很強，或所需單抗是用于抗原不同組分的純化或分析等，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。檢測用抗原可以是與免疫抗原純度相同，也可是不同的純度，這主要決定于所用篩檢方法的種類及其特異性和敏感性。2.2.1.

13、2. 免疫動物的選擇 根據所用的骨髓瘤細胞可選用小鼠和大鼠作為免疫動物。因為，所有的供雜交瘤技術用的小鼠骨髓瘤細胞系均來源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細胞都來源于LOU/c大鼠，所以一般的雜交瘤生產都是用這兩種純系動物作為免疫動物。但是，有時為了特殊目的而需進行種間雜交，則可免疫其他動物。種間雜交瘤一般分泌抗體的能力不穩(wěn)定，因為染色體容易丟失。就小鼠而言，初次免疫時以8-12周齡為宜，雌性鼠較便于操作。2.2.1.3 免疫程序的確定 免疫是單抗制備過程中的重要環(huán)節(jié)之一，其目的在于使B淋巴細胞在特異抗原刺激下分化、增殖，以利于細胞融合形成雜交細胞，并增加獲得分泌特異性抗體的雜交瘤的機會。

14、因此在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原。現用的免疫程序中多數是參照制備常規(guī)多克隆抗體的方法。表6-1列舉了目前常用的免疫程序。免疫途徑常用體內免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射，也采用足墊、皮內、滴鼻或點眼。最后一次加強免疫多采用腹腔或靜脈注射，目前尤其推崇后者，因為可使抗原對脾細胞作用更迅速而充分。在最后一次加強免疫后第3天取脾融合為好，許多實驗室的結果表明，初次免疫和再次免疫應答反應中，取脾細胞與骨髓瘤細胞融合，特異性雜交瘤的形成高峰分別為第4天和第22天，在初次免疫應答時

15、獲得的雜交瘤主要分泌IgM抗體，再次免疫應答時獲得的雜交瘤主要分泌IgG抗體。筆者體會陽性雜交瘤出現的高峰與小鼠血清抗體的滴度并無明顯的平行關系，且多在血清抗體高峰之前。因此，為達到最高的雜交瘤形成率需要有盡可能多的漿母細胞，這在最后一次加強免疫后第3天取脾進行融合較適宜。已有人報道采用脾內免疫，可提高小鼠對抗原的免疫反應性，且節(jié)省時間，一般免疫3天后即可融合。 、細胞融合 主要試劑的配制、 細胞培養(yǎng)基 雜交瘤技術中使用的細胞培養(yǎng)基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎培養(yǎng)基，具體配制方法按廠家規(guī)定的程序，配好后過濾除菌（0

16、.22um），分裝，4保存。不完全RPMI-1640培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基原液96ml100×L.G.溶液1ml雙抗溶液1ml7.5% NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml不完全DMEM培養(yǎng)基：DMEM 13.37g超純水或四蒸水980mlNaHCO3 3.7g雙抗溶液10ml100×L.G.溶液10ml用1N HCl調試PH至，過濾除菌，分裝4保存。完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基：不完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基80ml小牛血清15-20ml用于骨髓瘤細胞SP2/0和建株后的雜交瘤細胞培養(yǎng)。HT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培

17、養(yǎng)基99mlHT貯存液1mlHAT培養(yǎng)基：完全RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基98mlHT貯存液1mlA貯存液1ml、 氨基喋呤（A）貯存液（100×，4×10-5mol/L） : 稱取1.76mg氨基喋呤（Aminopterin MW 440.4），溶于90ml超純水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 0.5ml中和，再補加超純水或四蒸水至100ml。過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20保存。、 次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）貯存液(100×,H:10-2mol/L，T：1.6×10-3mol/L): 稱取136.1mg次黃嘌呤(Hypoxa

18、nthine,MW 136.1)和38.8mg胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW 242.2)，加超純水或四蒸水至100ml，置45-50水浴中使完全溶解，過濾除菌，分裝小瓶（2ml/瓶），-20凍存。用前可置37加溫助溶。、 L-谷氨酰胺（L.G.）溶液（100×，0.2mol/L） : 稱取2.92g L-谷氨酰胺（L-glutamine，MW 146.15），用100ml不完全培養(yǎng)液或超純水（或四蒸水）溶解，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20凍存。、 青、鏈霉素（雙抗）溶液（100×）: 取青霉素G（鈉鹽）100萬單位和鏈霉素（硫酸鹽）1g，溶于100m

19、l滅菌超純水或四蒸水中，分裝小瓶（4-5ml/瓶），-20凍存。、 7.5% NaHCO3溶液 : 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4保存。、 HEPES溶液（1mol/L）: 稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4保存。、 8-氮鳥嘌呤貯存液（100×）: 稱取200mg 8-

20、氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20凍存。使用時按1%濃度加入到培養(yǎng)液中（即終濃度為20ug/ml）。、 50% PEG: 稱取PEG 1000 或4000 20-50g于三角瓶中，蓋緊，60-80水浴融化，0.6ml分裝于青霉素小瓶中，蓋緊，8磅高壓蒸汽15分鐘，-20存放備用。臨用前加熱融化，加等量不完全培養(yǎng)基，用少許7.5% NaHCO3調PH至8.0，或購買Sigma或Gibco公司現成產品。 髓瘤細胞的準備   融合前骨髓瘤細胞維持的方式，對成

21、功地得到雜交瘤是最為重要的。目標是使細胞處于對數生長的時間盡可能長，融合前肯定不能少于1周。凍存的細胞在復蘇后要2周時間才能處于適合于融合的狀態(tài)，長過了的骨髓瘤細胞至少幾天才可能恢復。在實驗室中處于對數生長的骨髓瘤細胞維持在含10%小牛血清的培養(yǎng)基中，方法是用6個裝5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶，接種10倍系列稀釋的骨髓瘤細胞。1周后到細胞相當密而又未長過的一瓶重新移植。典型的倍增時間為14-16小時。骨髓瘤細胞懸液的制備方法如下：、 于融合前48-36小時，將骨髓細胞擴大培養(yǎng)（一般按一塊96孔板的融合試驗約需2-3瓶100ml培養(yǎng)瓶培養(yǎng)的細胞進行準備）。、 融合當天，用彎頭滴管將細胞從瓶壁瘤輕輕吹下，

22、收集于50ml離心管或融合管內。、 1000r/min離心5-10分鐘，棄去上清。d、 加入30ml不完全培養(yǎng)基，同法離心洗滌一次。然后將細胞重懸浮于10ml不完全培養(yǎng)基，混勻。、 取骨髓瘤細胞懸液，加0.4%臺盼藍染液作活細胞計數后備用。細胞計數時，取細胞懸液0.1ml加入0.9ml臺盼藍染液中，混勻，用血球計數板計數。計算細胞數目的公式為：每毫升細胞數=4個大方格細胞數×105/4；或每毫升細胞數=5個中方格細胞數×106/2 脾淋巴細胞的準備   取已經免疫的BALB/c小鼠，摘除眼球采血，并分離血清作為抗體檢測時的陽性對照血清。同時通過頸脫位致死

23、小鼠，浸泡于75%酒精中5分鐘，于解剖臺板上固定后掀開左側腹部皮膚，可看到脾臟，換眼科剪鑷，在超凈臺中用無菌手術剪剪開腹膜，取出脾臟置于已盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，輕輕洗滌，并細心剝去周圍結締組織。將脾臟移入另一盛有10ml不完全培養(yǎng)基的平皿中，用彎頭鑷子或裝在1ml注射器上的彎針頭輕輕擠壓脾臟（也可用注射器內芯擠壓脾臟），使脾細胞進入平皿中的不完全培養(yǎng)基。用吸管吹打數次，制成單細胞懸液。為了除去脾細胞懸液中的大團塊，可用200目銅網過濾。收獲脾細胞懸液，1000r/min離心5-10分鐘，用不完全培養(yǎng)基離心洗滌1-2次，然后將細胞重懸于10ml不完全培養(yǎng)基混勻，取上述懸液，加臺酚藍染

24、液作活細胞計數后備用。通常每只小鼠可得1×108-2.5×108個脾細胞，每只大鼠脾臟可得5×108-10×108脾細胞。 飼養(yǎng)細胞（Feeder cells）的制備   在細胞融合后選擇性培養(yǎng)過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養(yǎng)細胞。飼養(yǎng)細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件；也可能是為了滿足新生雜交瘤細胞對細胞密度的依賴性。常用的飼養(yǎng)細胞有胸腺細胞

25、、正常脾細胞和腹腔巨噬細胞。其中以小鼠腹腔巨噬細胞的來源及制備較為方便，且有吞噬清除死亡細胞及其碎片的作用，因此使用最為普遍。其制備方法如下： 按上述采小鼠脾細胞的方法將小鼠致死、體表消毒和固定后，用消毒剪鑷從后腹掀起腹部皮膚，暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器注射10ml不完全培養(yǎng)基至腹腔，注意避免穿入腸管。右手固定注射器，使針頭留置在腹腔內，左手持酒精棉球輕輕按摩腹部1分鐘，隨后吸出注入的培養(yǎng)液。1000r/min離心5-10分鐘，棄上清。先用5ml HAT培養(yǎng)基將沉淀細胞懸浮，根據細胞計數結果，補加HAT培養(yǎng)基，使細胞濃度為2×105/ml，備用。通常對巨噬細胞來說，9

26、6孔培養(yǎng)板每孔需2×104個細胞，24孔板每孔需105細胞。每只小鼠可得3-5×106個細胞，因此一只小鼠可供兩塊96孔板的飼養(yǎng)細胞。也可在細胞融合前1-2天制備并培養(yǎng)飼養(yǎng)細胞，這樣使培養(yǎng)板孔底先鋪上一層飼養(yǎng)細胞層。做法是，將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml（相當于2滴），然后置37 6% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合與雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng)    細胞融合的程序已報道的有很多種，這里介紹的是作者所在實驗室常用的一種。、 將1×108脾細胞與2×107-5×107骨髓瘤細胞SP2/0-Ag14混合于一支50ml融合

27、管中，補加不完全培養(yǎng)基至30ml，充分混勻。、 1000r/min離心5-10分鐘，將上清盡量吸凈。、 在手掌上輕擊融合管底，使沉淀細胞松散均勻;置40水浴中預熱。、 用1ml吸管在1分鐘左右（最佳時間為45秒）加預熱至40的50% PEG（PH 8.0）1ml，邊加邊輕輕攪拌。、 用10ml吸管在90秒內加20-30ml預熱至37的不完全培養(yǎng)基；20-37靜置10分鐘。、 1000r/min 5分鐘；棄去上清。、 加入5ml HAT培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細胞，使其懸浮并混勻，然后補加含腹腔巨噬細胞的HAT培養(yǎng)基至80-100ml。、 分裝96孔細胞培養(yǎng)板，每孔；分裝24孔板，每孔；然后將培養(yǎng)板

28、置37，6% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。、 5天后用HAT培養(yǎng)基換出1/2培養(yǎng)基。、 7-10天后用HT培養(yǎng)基換出HAT培養(yǎng)基；（第14天后可用普通完全培養(yǎng)基）。、 經常觀察雜交瘤細胞生長情況，待其長至孔底面積1/10以上時吸出上清供抗體檢測。、雜交瘤細胞篩選雜交瘤細胞在融合后2周左右即可篩選，即把分泌所需抗體的雜交瘤孔從眾多的孔中選出來，通常也稱為抗體檢測。抗體檢測的方法很多，通常根據所研究的抗原和實驗室的條件而定。但作為雜交瘤篩選的抗體檢測方法必須具有快速、準備、簡便，便于一次處理大量樣品等特點。因為往往有幾百個樣品需要在短短幾個小時就報告結果，以便決定雜交瘤細胞的取舍。所以選用抗體檢測方法的原

29、則是快速、敏感、特異、可靠、花費小和節(jié)省人力。一般說來，在融合之前就必須建立好抗體檢測方法，并克服可能存在的問題。另一個重要問題是抗體檢測方法所需要的“動力學范圍”，即檢出背景以上的最強與最弱信號之比，依所用的檢測抗原是否純凈而定。如雜交瘤抗體是針對純化的蛋白質抗原的，100%的抗原參與反應，一個陽性/陰性判別系統(tǒng)就夠了。另一方面，如果雜交瘤抗體是針對細胞表面微量的蛋白抗原，檢測系統(tǒng)可能需要能測出微弱信號，則動力學范圍至少應為10：1，最好為100：1。另外，檢測方法的選擇還受所需雜交瘤抗體的類型和預定的用途的影響。結合補體的抗體可以用基于細胞毒性反應的檢測方法來選出。如需結合A蛋白的雜交瘤抗

30、體，就要用結合蛋白A的檢測方法。下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法： 免疫酶技術   免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫學技術。由于它特異性強，靈敏度高，現已廣泛用于篩選和鑒定單抗。、器材和試劑. 包被緩沖液：碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml混合，再加75ml蒸餾水，調PH至9.6。Tris-HCl緩沖液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸餾水至1000ml。. 洗滌緩沖液

31、（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸餾水至1000ml。. 稀釋液和封閉液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗滌液至100ml；或用洗滌液將小牛血清配成5-10%使用。. 酶反應終止液（2mol/L H2SO4）：取蒸餾水178.3ml，滴加濃硫酸（98%）21.7ml。. 底物緩沖液（PH5.0，磷酸鹽-檸檬酸緩沖液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L檸檬酸24.3ml，再加50ml蒸餾水。檸檬酸溶液及配成的底物緩沖液不穩(wěn)定，易形成沉淀，因

32、此一次不宜配制過多。. 底物使用液：OPD底物使用液（測490nm的OD值）：OPD 5mg，底物緩沖液10ml，3% H2O2 0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（測450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物緩沖液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS底物使用液（測410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物緩沖液1ml，3% H2O2 2ul。. 抗體對照：以骨髓瘤細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，以免疫鼠血清作為陽性血清。. 抗原： 可溶性抗原：盡量純化，以獲得高特異性。病毒感染的傳代細胞或全菌抗原。淋巴細胞等懸液。. 酶標抗鼠抗體或酶標SPA或其他類

33、似試劑。. 細胞固定液：-20丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸餾水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1;1）；或-20甲醇。. 聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或條孔；硬板或軟板均可使用。. 酶聯免疫閱讀儀；或光鏡。. 吸管、加樣器及水浴箱、離心機等。、 可溶性抗原的酶聯免疫吸附試驗（ELISA）. 純化抗原用包被液稀釋至1-20ug/ml。. 以50-100ul/孔量加入酶標板孔中，置4過夜或37吸附2小時。. 棄去孔內的液體，同時用洗滌液洗3次，每次3-5分鐘，拍干。. 每孔加200ul封閉液4過夜或37封閉2小

34、時；該步驟對于一些抗原，可省略。. 洗滌液洗3次；此時包被板可-20或4保存?zhèn)溆谩? 每孔加50-100ul待檢雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，同時設立陽性、陰性對照和空白對照；37孵育1-2小時；洗滌，拍干。. 加酶標第二抗體，每孔50-100ul，37孵育1-2小時，洗滌，拍干。. 加底物液，每孔加新鮮配制的底物使用液50-100ul，3710-30分鐘。. 以2mol/L H2SO4終止反應，在酶聯免疫閱讀儀上讀取OD值。. 結果判定：以P/N?2.1，或P?N+3D為陽性。若陰性對照孔無色或接近無色，陽性對照孔明確顯色，則可直接用肉眼觀察結果。、 全菌抗原的ELISAS. 新鮮培養(yǎng)的細菌用蒸餾水或

35、PBS懸浮，并調整細菌濃度至1×108個/ml。必須指出，對于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。 . 每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶液5ml），37作用2小時，蒸餾水洗滌3次；加上述細菌懸液50ul/孔；37-56烘干；每孔加200ul封閉液4過夜或37 2小時封閉。. 步驟b也可采用先每孔加50ul細菌懸液，37-56烘干，然后用-20預冷的無水甲醇室溫作用15分鐘，蒸餾水洗滌3次；每孔加200ul封閉液4過夜或37 2小時封閉。. 洗滌液洗3次；此時包被板可在-20或4保存?zhèn)溆谩? 以下步驟同上法。、 用

36、全細胞抗原的ELISA. 按常規(guī)方法培養(yǎng)細胞，接種病毒，收獲感染細胞和未感染細胞，進行細胞計數，用PBS制成適當濃度懸液。. 淋巴細胞懸液的制備采用新鮮外周血加肝素抗凝后，滴加于淋巴細胞分離液之上，1500rpm離心30分鐘，吸取界面細胞洗滌二次，即為新鮮淋巴細胞懸液。該細胞懸液中若仍混有紅細胞，離心后加0.83%的氯化銨溶液，室溫10分鐘，洗滌一次即可。將該細胞懸液稀釋至適當濃度。. 每孔加100ul上述a或b的細胞懸液，使每孔含細胞5×104個；1500r/min 15分鐘，甩去上清；室溫干燥或吹干后用丙酮-甲醇（1：1）4固定10分鐘；可4或-20保存?zhèn)溆谩? 以下步驟同上法。

37、 免疫熒光技術   免疫熒光技術可用于多種抗原的雜交瘤抗體檢測，如細胞性抗原（包括細菌和動物細胞）、感染細胞中的病毒抗原和膜抗原等。其操作簡單、敏感性高，可直接觀察抗原定位等優(yōu)點，在McAb的篩選與鑒定上具有重要的應用價值。、器材和試劑. 供檢測抗體用的抗原制備?固定細胞片或板，活細胞懸液。. PBS（PH7.2，0.01mol/L）. 待檢的McAb樣品。. 冷丙酮. FITC（異硫氰酸熒光素）或TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明熒光素）標記的抗鼠Ig抗體等. 熒光顯微鏡，磁力攪拌器，離心機，水浴箱等。、間接免疫熒光法. 固定細胞片的制備：生長在蓋片上的細胞（接種或未接種病

38、毒），可直接收獲蓋片，在PBS中洗滌，用4丙酮固定10分鐘，空氣干燥，置密封容器于-20保存?zhèn)溆?；單細胞懸液可在蓋片上制成涂片，固定方法同上。細胞涂片的制備：將10ul細菌懸液（1×108個/ml）涂抹7×21mm蓋片上，自然干燥后，用-20丙酮固定10-15分鐘，于-20保存?zhèn)溆谩? 蓋片在去離子水中濕潤后置架上滴加10-20ul雜交瘤上清或其他待檢樣品；設立陽性、陰性對照；置37水浴孵育0.5-1小時。. 取出蓋片置PBS中用磁力攪拌器洗滌15分鐘。 蓋片置架上，滴加工作濃度的抗鼠Ig的熒光抗體10-20ul，37孵育0.5-1小時。 同法洗滌15分鐘；取出蓋片，用延緩

39、熒光碎滅的封載劑（如緩沖甘油，9份甘油加1份PBS）封于干凈載玻片上。. 光顯微鏡上觀察，陽性結果可見特異性熒光（FITC為黃綠色熒光，TRITC為桔紅色熒光）。. 細胞固定片的制備，也可改在培養(yǎng)板孔中進行，其余步驟同上，在觀察結果時，將培養(yǎng)板翻轉置于熒光顯微鏡下，判斷標準不變。 間接血凝試驗間接血凝試驗又稱被動血凝試驗（PHA），是目前應用較廣的檢測方法之一。本試驗是以包被可溶性抗原的紅細胞作為指示系統(tǒng)，當被檢抗體與包被在紅細胞上的抗原產生特異性反應時，導致紅細胞呈凝集現象?？梢?，該法具有靈敏、快速、容易操作和無需昂貴儀器等優(yōu)點，而且經改用醛化紅細胞以后，克服原來重復性差的缺點。、 器材和試

40、劑. 綿羊抗凝血，或人“O”型抗凝血。. 緩沖液：PBS（PH7.2）；醋酸緩沖液。. 甲醛，丙酮醛，NaN3，抗凝劑等。. 血凝板，振蕩器等。、 多糖抗原的間接血凝試驗. 甲醛化綿羊紅細胞的制備：無菌采集綿羊頸靜脈血50ml，用枸櫞酸鈉作抗凝劑；用5倍于紅細胞壓積的PH7.2 PBS（Na2HPO412H2O 3.58g，KH2PO4 0.41g，NaCl 8.01g，蒸餾水1000ml）充分洗滌5次，每次1500r/min 5-10分鐘，直至上清測定無蛋白質（用飽和硫酸銨滴定上清，觀察有無白色沉淀），再以相同緩沖液配成25%紅細胞懸液；將25%紅細胞懸液與20%甲醛以2.5：1的比例混勻，

41、37水浴作用2小時，每15分鐘振蕩一次，紅細胞顏色逐漸由鮮紅色轉變?yōu)樽厣?；以PH7.2 PBS洗滌4次，每次2000r/min 10分鐘，再以同樣的PBS制成25%紅細胞懸液；其后，重復醛化一次，方法同前；最后配成20%醛化綿羊紅細胞懸液，加甲醛至0.3%防腐，4保存?zhèn)溆谩? 脂多糖抗原致敏甲醛化綿羊紅細胞的制備：取脂多糖（LPS），以0.2mol/L PH8.0 PB液，調整多糖濃度至120ug/ml，然后100水浴處理1小時；將冷卻至37的熱處理LPS與6%醛化紅細胞等量混合，37攪拌作用45分鐘；取出離心2000r/min 10分鐘，以0.01mol/L PH7.2 PBS洗滌4次；配制

42、成4%致敏血球，分裝，保存于4備用，或凍干保存。. McAb的篩選：取待測McAb樣品25ul，加入V型微量血凝板孔中，同時設立陰性、陽性對照；再加入0.5-4%致敏紅血球懸液25ul，在振蕩器上混勻30秒；置室溫或37 30-60分鐘觀察結果。陰性對照孔應呈緊縮的圓點。 放射免疫測定   放射免疫測定是用放射性同位素標記抗原或抗體，以檢測相應抗原或抗體的定量方法。在篩選和鑒定單抗時常用抗原固相法，即用抗原包被聚乙烯微板，借以檢測樣品中的McAb，其操作步驟如下：. 用碳酸鹽緩沖液將抗原稀釋至適宜的濃度（1-100ug/ml），滴加聚乙烯微板孔內，100ul/孔，4過夜或3

43、7 2小時。. 棄去抗原液，每孔加100ul含0.5-1% BSA的PBS，4 1-2小時封閉。. 用BSA-PBS洗滌3次，每次3分鐘。. 加待檢樣品，每孔100ul，設立陰性孔、陽性孔和空白孔；371-2小時，同法洗滌。. 每孔加125I標記的抗鼠Ig抗體工作液100ul，37 1-2小時，同法洗滌。. 用-射線閃爍計數儀分別測定各孔放射性。通常要求樣品孔和陽性對照孔的放射性脈沖分別超過本底5倍和10倍。若以空白孔的放射性為基準，凡樣品孔與陰性孔放射性之比大于3的樣品定為陽性。、雜交瘤細胞的克隆化從原始孔中得到的陽性雜交瘤細胞，可能來源于二個或多個雜交瘤細胞，因此它們所分泌的抗體是不同質的

44、。為了得到完全同質的單克隆抗體，必須對雜交瘤細胞進行克隆化。另一方面，雜交瘤細胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細胞丟失部分染色體，可能喪失產生抗體的能力。為了除去這部分已不再分泌抗體的細胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細胞系（又稱亞克?。?，也需要克隆化。另外，長期液氮凍存的雜交瘤細胞，復蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，因此也應作克隆化，以檢測抗體分泌情況。通常在得到針對預定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進行2-3次克隆化，有時還需進行多次。所謂克隆化是指使單個細胞無性繁殖而獲得該細胞團體的整個培養(yǎng)過程。克隆化的方法很多，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細胞顯微操作法、單克隆細胞集團顯微操作法和熒光激活細胞分

45、類儀（FACS）分離法。這里介紹最簡單也是使用最廣泛的前兩種方法。 有限稀釋法2.2.4.1.1 材料：. 96孔細胞培養(yǎng)板等；. HT培養(yǎng)基；. 活力強的雜交瘤細胞；. 小鼠腹腔細胞。2.2.4.1.2 方法：. 制備小鼠腹腔細胞。同“細胞融合”一節(jié)中的方法。. 制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，用含20%血清的HT培養(yǎng)基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細胞3中不同的稀釋度。. 按每毫升加入5×104-1×105細胞的比例，在上述雜交瘤細胞懸液中分別加入腹腔巨噬細胞。. 每種雜交瘤細胞分裝96孔板一塊，每個稀釋度32孔，每孔量為0.2ml，每孔的雜交瘤細胞數分別為0.5、3和

46、10。. 37、7.5% CO2濕潤培養(yǎng)7-10天，出現肉眼可見的克隆即可檢測抗體；在倒置顯微鏡下觀察，標出只有單個克隆生長的孔，取上清作抗體檢測。. 取抗體檢測陽性孔的細胞擴大培養(yǎng)，并凍存。. 本法中、也可簡化為將計數后的雜交瘤細胞準確地進行系列稀釋，直至每毫升含10個細胞，按每孔接種0.1ml細胞懸液，即每孔含1個細胞。 軟瓊脂法材料：. HT培養(yǎng)基（雙倍濃度）。. 用0.15mol/L NaCl配制的2.0%瓊脂糖：稱取2.0g細胞培養(yǎng)用瓊脂糖，懸浮于100ml 0.15mol/L NaCl，121高壓滅菌15分鐘，分裝10ml小瓶，冷卻后4保存。. 小鼠腹腔細胞。. 滅菌平皿。. 45

47、水浴。. 活力很好的雜交瘤細胞。2.2.4.2. 方法：2.2.4.2.1. 在培養(yǎng)皿中制備飼養(yǎng)細胞（小鼠腹腔細胞）單層。2.2.4.2.2. 臨用前將2.0%瓊脂糖生理鹽水溶液與等量雙倍濃度的HT培養(yǎng)液混勻，配成1%瓊脂糖培養(yǎng)液，45水浴中溫育。2.2.4.2.3. 吸去平皿上層培養(yǎng)液，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液3ml，室溫10分鐘。2.2.4.2.4. 取雜交瘤細胞懸液1ml，加入1%瓊脂糖培養(yǎng)液1ml混勻，鋪于上層。2.2.4.2.5. 37、7.5%濕潤培養(yǎng)7-14天；克隆生長至2mm時，用毛細吸管吸出克隆，直接轉種于含有飼養(yǎng)細胞的24孔板，擴大培養(yǎng)。2.2.4.2.6. 吸取上清，檢測抗體

48、，陽性孔可繼續(xù)克隆化，或擴大培養(yǎng)、凍存。 、雜交瘤細胞的凍存與復蘇 雜交瘤細胞的凍存   在建立雜交瘤細胞的過程中，有時一次融合產生很多“陽性”孔，來不及對所有的雜交瘤細胞作進一步的工作，需要把其中一部分細胞凍存起來；另一方面，為了防止實驗室可能發(fā)生的意外事故，如停電、污染、培養(yǎng)箱的溫度或CO2控制器失靈等給正在建立中的雜交瘤帶來災難，通常盡可能早地凍存一部分細胞作為種子，以免遭到不測。在雜交瘤細胞建立以后，更需要凍存一大批，以備今后隨時取用。細胞凍存的原理是細胞在加血清和二甲基亞砜的培養(yǎng)基中以一定的緩慢速度下降溫度（0? -20，每分鐘下降1；-20? -40每分鐘下降2

49、），可在-196液氮或液氮蒸氣中長期保存。下面介紹我們實驗室的細胞凍存方法，經幾年來對多種細胞的使用，細胞復蘇存活率均在80%以上。、材料：. 帶蓋吸管筒一只（鋁質或洋鐵皮制），內壁（包括筒底和蓋）襯1-2層石棉紙或石棉布。. 含10-20%血清、5-10% DMSO的HT培養(yǎng)基，冰浴降溫至0左右（用作凍存液）。. 滅菌安瓶或帶蓋小瓶。. -70冰箱。. 液氮及液氮罐。. 處于對數生長中期、健康而活力好的雜交瘤細胞。、方法：. 將雜交瘤細胞（或其他細胞）離心，重新懸浮于預冷的凍存液中，濃度為106-107左右/ml，分裝安瓶，每瓶1ml，置冰浴上；安瓶上標明細胞名稱、凍存日期、批號等。. 安瓶

50、封口后仍置冰浴上。. 將安瓶放入一帶收口繩的小布袋內，布袋上標明凍存號、細胞名稱等，立即將布袋放入吸管筒內，置-70冰箱。. 2-4小時后或過夜后從-70冰箱取出吸管筒，將盛有細胞的布袋移入液氮罐；在布袋的線繩上作好標記或代碼；最后在液氮凍存簿上作詳細記錄。. 液氮罐應定期補充液氮（最好是專人管理）；補充液氮及存取細胞時應帶保護眼鏡和手套，以免因液氮凍傷等。 雜交瘤細胞的復蘇   雜交瘤細胞、骨髓瘤細胞或其他細胞在液氮中保存，若無意外情況時，可保存數年至數十年。復蘇時融解細胞速度要快，使之迅速通過最易受損的-5?0，以防細胞內形成冰晶引起細胞死亡。通常情況下，凍存時細胞數量

51、多，生長狀態(tài)好的雜交瘤細胞系以及其他細胞的復蘇可采用以下方法，這也是各個實驗室普遍采用的程序。即復蘇時，從液氮中取出安瓶，立即在37水浴融化，待最后一點冰塊快要融化時，從水浴中取出，置冰浴上。用5-10ml HT培養(yǎng)基稀釋，1000r/min 10分鐘，棄上清，再懸浮于適量HT培養(yǎng)基中，轉入培養(yǎng)瓶或24孔板，置37，7.5% CO2培養(yǎng)。如果細胞存活力不高，死細胞太多，可加104-105/ml小鼠腹腔細胞進行培養(yǎng)。不過，凍存的細胞并不都能100%復蘇成功，其原因較多，如凍存時細胞數量少或生長狀態(tài)不良，或復蘇時培養(yǎng)條件改變或方法不當，也可能細胞受細菌或支原體污染，以及液氮罐保管不善等。在出現上述

52、情況時，可采用一些補救方法復蘇這些細胞，如小鼠皮下形成實體瘤法，脾內接種法，小鼠腹腔誘生腹水和實體瘤法，以及96孔板培養(yǎng)法等。、單抗特性的鑒定  單克隆性的確定 包括雜交瘤細胞的染色體分析、單抗免疫球蛋白重鏈和輕鏈類型的鑒定和單抗純度鑒定等。、 雜交瘤細胞的染色體分析對雜交瘤細胞進行染色體分析可獲得其是否是真正的雜交瘤細胞的客觀指標之一，雜交瘤細胞的染色體數目應接近兩種親本細胞染色體數目的總和，正常小鼠脾細胞的染色體數目為40，小鼠骨髓瘤細胞SP2/0為62-68，NS-1為54-64；同時骨髓瘤細胞的染色體結構上反映兩種親本細胞的特點，除多數為端著絲點染色體外，還出現少數標志染色體

53、。另一方面，雜交瘤細胞的染色體分析對了解雜交瘤分泌單抗的能力有一定的意義，一般來說，雜交瘤細胞染色體數目較多且較集中，其分泌能力則高，反之，其分泌單抗能力則低。檢查雜交瘤細胞染色體的方法最常用秋水仙素法，其原理是應用秋水仙素特異的破壞紡錘絲而獲得中期分裂相細胞；再用0.075mol/L KCl溶液等低滲處理，使細胞膨脹，體積增大，染色體松散；經甲醇-冰醋酸溶液固定，即可觀察檢查。其操作步驟如下：. 在加秋水仙素前48-36小時將雜交瘤細胞傳代。. 秋水仙素處理：在培養(yǎng)瓶中加入秋水仙素（100ug/ml，除菌，-20保存），使最終濃度為（若改用秋水仙胺則最終濃度為）；繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時，然后吹打

54、細胞，移入離心管中，1000r/min 10分鐘，棄上清。. 加入已預溫到37的0.075mol/L KCl溶液5ml，將沉淀細胞懸浮并混勻，37水浴15-20分鐘。. 向懸液中加入新配制的固定液（甲醇與冰醋酸3：1混合）1ml，混勻，然后1000r/min 10分鐘，棄去上清液；本步驟的目的是使細胞表面輕微固定，可防止固定后細胞粘連成團塊。. 加入固定液5ml，將細胞懸浮并混勻，室溫靜置20-30分鐘，然后1000r/min 10分鐘，棄去上清液；重復操作一次；其后加5ml固定液，將細胞懸浮并混勻，封上管口，置4過夜。. 取出離心管，1000r/min 5分鐘，輕輕吸去上清液，根據細胞壓積多

55、少而留下0.5-1ml固定液，將細胞懸浮并混勻后，吸取細胞懸液1-2滴，滴在剛從冰水中取出的載玻片上，用口吹散，并在火焰上通過數次，使細胞平鋪于載玻片上，自然干燥。. 用新配制的10% Giemsa染液染色10-20分鐘，然后用自來水洗去染液，自然干燥。（Giemsa染液配方：Giemsa粉0.5g，甘油33ml，55-60保溫2小時，加甲醇33ml混勻，保存于棕色瓶內作為原液；取原液1份，加1/15mol/L PH6.8 PBS 9份，即成10% Giemsa染液）。. 鏡檢：選擇染色體分散好，無重疊，無失散的細胞進行觀察分析。每份標本應計數100個完整的中期核細胞，并注意觀察是否有標志染色

56、體。、 抗免疫球蛋白的類別和亞類鑒定抗體的類和亞類對決定提純的方法有很大的幫助。除采用特殊的免疫方法和檢測方法，最經常得到的單抗是IgM和IgG，分泌IgE的雜交瘤細胞很少見，而分泌IgA的雜交瘤通常只有在用于融合的淋巴細胞來自腸道相關淋巴組織才能得到。如在抗體檢測中使用葡萄球菌A蛋白試劑，則不可能得到IgG以外的其他類的抗體。鑒定單抗Ig類和亞類的方法主要有兩種，一種是免疫擴散，另一種是ELISA。 免疫擴散法這種方法簡便、準確，最常用。被檢的McAb樣品通常為雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液，由于其中單抗的濃度較低，應先將其濃縮10-20倍左右再檢測。小鼠腹水中的單抗?jié)舛入m很高，但也含有小鼠本身的各類

57、Ig，它們也會與相應抗血清發(fā)生反應，使鑒定結果出現混亂，即使將腹水稀釋10-20倍后再檢測也不能完全避免上述情況的發(fā)生，因此一般不用腹水型單抗作為被檢樣品。材料：. 小鼠IgG及其亞類IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM、IgA的抗血清。. 0.06mol/L巴比妥鈉-鹽酸緩沖液（PH8.6）。. 1%瓊脂糖凝膠：1g瓊脂糖加入100ml 0.06ml/L PH8.6巴比妥鈉-鹽酸緩沖液中，隔水煮沸溶解，加0.02% NaN3防腐，4保存?zhèn)溆谩? 潔凈載玻片，打孔器（直徑3mm），濕盒，酒精燈。方法：. 雜交瘤細胞培養(yǎng)上清液的濃縮：取該上清液10ml裝入透析袋中，用線扎緊，放在小

58、燒杯中，透析袋周圍堆置PEG6000或蔗糖或PVP（聚乙烯吡咯烷酮 polyvinylpyrrolidone），放于4數小時，待透析袋內液體量濃縮至約0.5-1ml時，吸出，可于-20保存?zhèn)溆?；也可采用吹風蒸發(fā)濃縮。. 加熱溶化1%瓊脂糖凝膠，鋪制瓊脂糖板，每片約3ml。. 待瓊脂凝固后，用打孔器在瓊脂板上打出梅花形的小孔（中央1孔，周圍6孔），然后封底。. 向中央孔加入抗小鼠IgG類或亞類抗血清，周圍孔加入待檢樣品；加樣后將瓊脂板放入濕盒，置37水浴箱中12-24小時或4過夜，觀察結果。2.2.6.1.2.2 ELISA法該法不需要將樣品濃縮，而且比免疫擴散法更快地得到結果。2.2.6.1.2.2.1 材料：. ELISA所需用溶液同雜交瘤細胞的篩選一節(jié)。. 酶標板。. 山羊抗鼠Ig；兔抗小鼠Ig類及亞類特異性血清；HRP結合的山羊抗兔Ig等。. 待檢雜交瘤細胞培養(yǎng)上清；陰性、陽性對照樣品。方法：. 每孔加入適量的100ul山羊抗小鼠Ig，室溫2小時；洗滌液洗2次。. 每孔加200ul封閉液，室溫作用1小