利用酶聯(lián)免疫法定量檢測腫瘤標(biāo)志物Hsp90α

1、利用酶聯(lián)免疫法定量檢測腫瘤標(biāo)志物Hsp90深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 12藥學(xué)1 XXX一、定量檢測Hsp90的臨床應(yīng)用價值腫瘤標(biāo)志物（Tumor marker，TM）是指在惡性腫瘤發(fā)生和增殖過程中，由腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)而合成分泌的或是由機(jī)體對腫瘤反應(yīng)而異常產(chǎn)生和升高的，反映腫瘤存在和生長的一類物質(zhì)。理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)靈敏度高，特異性好，能夠明確地區(qū)分腫瘤患者與非腫瘤患者；針對某一種腫瘤，具有組織器官特異性，能對腫瘤進(jìn)行定位；與病情嚴(yán)重程度、腫瘤大小或分期有關(guān)；能監(jiān)測腫瘤治療效果和腫瘤的復(fù)發(fā)。熱休克蛋白（Heat shock proteins，Hsp）90是一個伴侶蛋白，能夠輔助蛋白折疊和維持細(xì)胞內(nèi)多種

2、信號傳導(dǎo)蛋白的穩(wěn)定，從而促進(jìn)細(xì)胞存活和生長。在腫瘤細(xì)胞中，Hsp90能夠使過度激活或突變的信號傳導(dǎo)蛋白保持活性，加速了腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)變。研究發(fā)現(xiàn)Hsp90的分泌水平隨腫瘤細(xì)胞侵襲程度的增加而升高，表明分泌型Hsp90與腫瘤的侵襲呈正相關(guān)1，隨后，Hsp90作為肺癌相關(guān)腫瘤標(biāo)志物被證明，可用于肺癌患者的病情監(jiān)測和療效評價2，亦可作為診斷肺癌尤其是早期肺癌診斷的參考。另外，由于目前常用的腫瘤標(biāo)志物既存在于腫瘤中，也存在于正常人群和非腫瘤病人的血液和體液中，不能單憑腫瘤標(biāo)志物超過參考范圍確診患癌。因此，人們期待通過“一滴血”或“一泡尿”早期確診腫瘤的技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。二、定量檢測Hsp90的背

3、景在腫瘤標(biāo)志物出現(xiàn)之前，肺癌的診斷及肺癌患者的療效評價常有影像學(xué)方法尤其是CT檢查常用于確定腫瘤的部位、大小及與周圍組織的毗鄰關(guān)系，是腫瘤診斷、分期及治療方式選擇的重要依據(jù)，也可做大致的定性診斷；病理學(xué)檢查，其結(jié)果準(zhǔn)確性高，但是因?yàn)樾枰〉米銐虻慕M織標(biāo)本用于檢查，常常需要多點(diǎn)取材或多次取材，而且部分患者因?yàn)椴∽儾课坏仍驘o法成功獲得組織標(biāo)本，最后需行手術(shù)切除方能明確診斷，過程繁瑣。支氣管鏡活檢，對中央型肺癌的診斷結(jié)果準(zhǔn)確，但該方法為侵襲性操作，部分患者不愿接受或不能耐受。Hsp90作為肺癌腫瘤標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，可通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunosorbent assa

4、y，ELISA）定量檢測其含量。此檢測手段具價格便宜，操作簡單等優(yōu)點(diǎn)。定量檢測Hsp90含量結(jié)果，能為醫(yī)生制定和及時調(diào)整治療方案提供參考，在診斷肺癌方面，由于單一的腫瘤標(biāo)志物檢測結(jié)果并不理想，目前尚不能滿足臨床需要，為提高檢測的特異性、敏感度及準(zhǔn)確性，常采用多種腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合診斷的方式。而Hsp90定量檢測試劑盒的準(zhǔn)確率高于目前常用的兩種肺癌腫瘤標(biāo)志物檢測試劑2，其也是診斷肺癌的參考指標(biāo)，且隨著研究的深入，該方法未來通過單一定量檢測Hsp90來確診肺癌。三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是先將已知的抗體或抗原結(jié)合在某種固相載體上，并保持其免疫活性。測定時，將待測樣本和酶標(biāo)抗原或抗體按不同步驟

5、與固相載體表面吸附的抗體或抗原發(fā)生反應(yīng)。洗去多余抗原-抗體復(fù)合物和游離成分。然后加入酶的作用底物催化顯色，進(jìn)行定性或定量測定。以雙抗體夾心法為例，基本過程如圖1所示。圖1酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)過程（一）雙抗體夾心法（Double antibody sandwich，DAS-ELISA）雙抗體夾心法，屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原最常用的ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體

6、的量相對于待測抗原是過量的,因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比（在方法可檢測范圍內(nèi)）。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成有色物質(zhì)，通過測定其O.D值，即可確定待測抗原含量。若固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個不同的抗原決定簇結(jié)合，則屬于雙位點(diǎn)夾心法。若采用固相載體上的抗原和酶標(biāo)抗原分別與樣品中被檢測抗體分子結(jié)合，則是雙抗原夾心法。（二）間接法（Indirect ELISA）此法是檢測抗體最常用的方法，其原理是將特異性抗原吸附到固相載體上，加入待測樣本（含相應(yīng)抗體）與之結(jié)合。溫育后洗滌，加入酶標(biāo)抗球蛋白抗體（酶標(biāo)抗體）和底物進(jìn)行測定。此法是測定抗體最常用的方法,

7、屬非競爭結(jié)合試驗(yàn)。其原理是將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)合物，再用酶標(biāo)二抗（針對受檢抗體的抗體，如羊抗人IgG抗體）與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，測定加底物后的顯色程度，確定待測抗體含量。（三）競爭法（Competing ELISA）此法用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，將抗體吸附到固相載體上，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量成反比。競爭法ELISA可用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進(jìn)行檢測。其方法和特點(diǎn)是：酶標(biāo)記抗原（抗體）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)體中的非標(biāo)記抗

8、原或抗體具有相同的與固相抗體（抗原）結(jié)合的能力；反應(yīng)體系中，固相抗體（抗原）和酶標(biāo)抗原（抗體）是固定限量，且前者的結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記抗原（抗體）的分子量和；免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標(biāo)抗原（抗體）的量（酶活性）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中非標(biāo)記抗原（抗體）的濃度成反比。間接法與競爭法的ELISA形式如圖2所示。圖2（四）其他ELISA隨著ELISA在方法學(xué)上的改進(jìn)和衍化，使其不斷有各具特點(diǎn)的新測定法問世，如應(yīng)用生物素-親和素放大系統(tǒng)（Biotin avidin system，BAS）的ELISA；利用酶催化底物發(fā)熒光的酶聯(lián)免疫熒光測定（Enzyme linked immuno

9、fluorecence，ELFIA）；斑點(diǎn)-ELISA（Dot-ELISA）和酶聯(lián)免疫電轉(zhuǎn)移印跡法（Enzyme linked immunoelectrotransfer blot，ELTB）以及酶聯(lián)免疫化學(xué)發(fā)光測定（Enzyme linked immunochemiluminescence assay，ELICLA）等。四、利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量檢測Hsp90的流程酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量檢測Hsp90過程如圖3。圖3利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量檢測Hsp90的流程圖五、利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)定量檢測Hsp90的過程（一）Hsp90單克隆抗體制備使用Hsp90蛋白免疫小鼠，初次免疫使用抗原100g加

10、福氏完全佐劑背部皮下多點(diǎn)注射；3周后第二次免疫，劑量同上，加福氏不完全佐劑腹腔內(nèi)注射；再過3周后第三次免疫，劑量同上；另3周后加強(qiáng)免疫，劑量200g，腹腔內(nèi)注射。3天后取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，使用HAT進(jìn)行篩選，有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化，免疫印跡和ELISA的方法進(jìn)行鑒定，最終得到分泌特異性識別Hsp90的鼠源抗體的雜交瘤細(xì)胞株。根據(jù)相同步驟使用Hsp90蛋白免疫兔子，最終得到分泌特異性識別Hsp90的兔源抗體的雜交瘤細(xì)胞株。（二）酶標(biāo)抗體利用戊二醛二步法3制備辣根過氧化物酶（Horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記兔源Hsp90抗體：第一步，酶液中加戊二醛使其濃

11、度為1.25%，室溫放置一段時間。過SephadexG-25層析柱（60×0.9cm）除去多余的戊二醛，收集棕色部分已活化的酶液，濃縮至適量體積；第二步，加提純的兔源Hsp90抗體于上述活化酶液中，再加1mol/L碳酸氫鈉緩沖液pH9.5，在4放置一天。然后加賴氨酸（以阻斷殘余的醛根），室溫放置一段時間，對0.01mol/L PBS（Phosphate Buffered Saline，磷酸鹽緩沖液），pH7.5，4透析過夜。得酶標(biāo)抗體，經(jīng)純化后分裝，-20保存?zhèn)溆?。（三）固定Hsp90抗體用包被緩沖液將鼠源Hsp90抗體稀釋至10g/mL，在96孔微孔板中每孔加入適量體積，于4

12、86;C下包被過夜。用PBST（Twain buffer phosphate，磷酸鹽吐溫緩沖液）洗滌96孔板3次，PBS洗滌1次。用封閉緩沖液于37ºC下封閉一段時間。再將96孔板倒置于吸水紙上，輕拍板去除板內(nèi)殘余洗滌液。得到固定好Hsp90抗體的酶標(biāo)板。（四）標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣上樣用抗體稀釋液梯度稀釋Hsp90校準(zhǔn)品以做標(biāo)準(zhǔn)曲線：每個濃度設(shè)2個復(fù)孔，分別加入酶標(biāo)板中。同時用抗體稀釋液將待測血漿樣品稀釋10倍，分別加入酶標(biāo)板中，每孔加入適量體積，每個樣品設(shè)3個復(fù)孔。于37ºC孵育一段時間。使固相抗原與加入的抗體充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用PBST洗滌酶標(biāo)板3次，PBS洗滌1次，洗去

13、未與固相抗原結(jié)合的抗體及其他雜質(zhì)，將酶標(biāo)板倒置于吸水紙上，輕拍板去除殘余洗滌液。（五）加酶標(biāo)抗體及顯色液用抗體稀釋液稀釋前述制備的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Hsp90抗體，加入酶標(biāo)板中，每孔加入適量體積。37ºC下孵育一段時間。PBST洗滌酶標(biāo)板3次，PBS洗滌1次。在酶標(biāo)板中加入3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺（3，3，5，5-Tetra methyl benzidine，TMB）和雙氧水，避光反應(yīng)。（六）終止反應(yīng)后測定吸光值H2SO4終止反應(yīng)。用紫外分光光度計設(shè)定好程序，在=380nm3處檢測吸光值。通過Hsp90校準(zhǔn)品濃度及吸光值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測出檢測樣品O.D值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計算出待測樣中Hsp90的含量。綜上所述，酶聯(lián)免疫吸附法具有設(shè)備價格便宜、折舊損耗小、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，且其檢測準(zhǔn)確性高，是一種良好的用于檢測抗原、抗體物質(zhì)的方法。用于腫瘤標(biāo)志物的定量檢測能很好的反映腫瘤標(biāo)志物在體內(nèi)的含量，采用酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測Hsp90含量，為醫(yī)生在肺癌患者的病情監(jiān)測和用藥選擇上提供了參考。同時，利用酶聯(lián)免疫吸附法定量檢測的準(zhǔn)確性并隨著對腫瘤標(biāo)志物研究的深入，使得未來通過定量檢測單一腫瘤標(biāo)志物早期快速確診腫瘤成為可能。參考文獻(xiàn)1 Xiaofeng Wang，Xiaomin Song，Wei Zhou，et al. The regulatory mechanism