體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療失神經(jīng)肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究

1、體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞移植治療失神經(jīng)肌萎縮的實(shí)驗(yàn)研究    【摘要】  目的：觀察維甲酸（RA）體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞后體內(nèi)移植治療失神經(jīng)肌萎縮的效果。方法：共使用成年SD 大鼠28 只，切斷兩側(cè)坐骨神經(jīng)，隨機(jī)選擇一側(cè)直接吻合坐骨神經(jīng)作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組從孕齡15 d 的胚胎SD 大鼠脊髓組織中分離獲得脊髓源性神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)維甲酸（RA）體外誘導(dǎo)后，顯微注射到SD 大鼠失神經(jīng)支配的一側(cè)踇長(zhǎng)伸肌中，術(shù)后16 周神經(jīng)電生理和免疫組織化學(xué)等方法觀察。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的踇長(zhǎng)伸肌

2、肌肉纖顫電波幅度，神經(jīng)肌纖維傳導(dǎo)速度的數(shù)目無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P  0.05）。結(jié)論：神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)后體內(nèi)移植具有治療失神經(jīng)肌萎縮的作用?！娟P(guān)鍵詞】  干細(xì)胞；維甲酸；膽堿能神經(jīng)元observe the effect of induction of neural stem cells in vitro and then to preventdenervation muscular atrophy&

3、#160;in vivo. Methods The spinal cord-derived neural stem cells of SD fetal rats afterpregnant 15 days were harvested and cultivated in serumfree medium, differentiated and in

4、duced by RA in vitro,Thenneural stem cells were random microinjected into single extensor hallucis longus of 28 SD rats which were transectedsciatic nerve ,others choosen as&#

5、160;control groups which were repaired sciatic nerves, the two groups were examined bymuscular electrophysiological examination and cellular immunohistochemistry 16 weeks postoperatively. Results

6、The differents of the mean peak of CMAP(extent of muscle fibrillation waves) , the mean NCV（velocity of musclefiber nerve conduction）in experiment group and normal control gro

7、up was not statistically significant (P > 0.05).Conclusions Neural stem cells by diferentiated into cholinergic neurons induced with RA in vitro can therapydenervation muscular 

8、atrophy in vivo.    Key Words Stem cells; Retinoic acid; Cholinergic neuron    失神經(jīng)支配后，骨骼肌立即停止收縮，肌組織失去神經(jīng)元原來的營養(yǎng)因子，發(fā)生萎縮、纖維化、往往再生的神經(jīng)軸突尚未到達(dá)靶肌肉，運(yùn)終板已經(jīng)發(fā)生碎裂和崩解，導(dǎo)致功能無法恢復(fù)，這是外周神經(jīng)損傷后治療極為棘手的問題。神經(jīng)干細(xì)胞是一群具有多向分化潛能的原始細(xì)胞，在特定的因素影響或誘導(dǎo)下，能

9、向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化1，2。將其作為細(xì)胞移植材料對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和外傷引起的神經(jīng)元缺失具有良好效果，而且已有臨床應(yīng)用報(bào)道。在2006 年8 月2008 年2 月間，我們利用在體外培養(yǎng)誘導(dǎo)的胎鼠脊髓的神經(jīng)干細(xì)胞移植到SD 大鼠切斷神經(jīng)支配的踇長(zhǎng)伸肌的上1/3 部，觀察其在治療失神經(jīng)肌萎縮中的作用。    1 材料與方法    1.1 材料    DMEM/F10（Gibco），

10、B27(Sigma)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，R&D），維甲酸（Gibco），神經(jīng)元無血清限定性培養(yǎng)基（Gibco），胎牛血清( 四季青)， 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate bufferedsolution，PBS）（Sigma）， 兔抗大鼠神經(jīng)上皮干細(xì)胞蛋白(nestin) 抗體、兔抗大鼠膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（CHAT）抗體、兔抗大鼠神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白（GFAP）抗體、兔抗大鼠微管相關(guān)蛋白2（MAP2）抗體；FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗和Cy3 標(biāo)記的羊抗兔二抗，熒光顯微鏡。   

11、 1.2 胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)與誘導(dǎo)參照Reynolds 等3 的方法，孕15 d 的重約250g SD 大鼠頸椎脫臼致死，酒精浸泡消毒后移入無菌操作箱，取出胎鼠去頭，用顯微器械取出脊髓組織，于10 倍手術(shù)顯微鏡下去除脊髓外膜，在預(yù)冷的DHankS 液中用吸管緩慢吹打數(shù)次，使其分離成單細(xì)胞，將細(xì)胞懸液移至離心管中，1 500 r/min 離心5 min 棄去上清液，用限定性培養(yǎng)液（內(nèi)含DMEM/F10、2  B27，20&

12、#160;ng/mL bFGF） 重懸細(xì)胞沉淀，37、5 CO2 條件下懸浮培養(yǎng)，視細(xì)胞生長(zhǎng)情況每隔35 d 換液1 次。3 周后吸取部分神經(jīng)干細(xì)胞的免疫熒光鑒定，檢測(cè)抗原為Nestin，神經(jīng)干細(xì)胞純度達(dá)到90。在上述神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入維甲酸（RA,5 mol/L）后置于37、5 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于3 周后取培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)用兔抗大鼠MAP2一抗（1:200），Cy3 標(biāo)志的羊抗兔二抗（1:50），兔抗大鼠GFAP 一抗（1:200），F(xiàn)ITC&

13、#160;標(biāo)記的羊抗兔二抗（1:50）來檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的分化，再次以小鼠抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT) 抗體雙重標(biāo)記。免疫熒光鑒定，熒光顯微鏡下觀察拍照。    1.3 體外誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)移植    1.3.1 動(dòng)物模型制作 200250 g 成年健康SD大鼠28 只（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），質(zhì)量百分比為1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后消毒鋪單。于雙側(cè)大腿后外側(cè)行直切口，顯露坐骨神經(jīng)，于中段處切斷，實(shí)驗(yàn)分兩組：隨機(jī)選擇一側(cè)直接吻合修復(fù)坐骨神經(jīng)（

14、對(duì)照組），另外一側(cè)顯微種植體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞懸液于踇長(zhǎng)伸肌上1/3 部（實(shí)驗(yàn)組），術(shù)后飼養(yǎng)16 周。    1.3.2 細(xì)胞移植、取材與免疫組化鑒定 將已經(jīng)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞與DMEM 培養(yǎng)液混合后制成濃度為105 mL 懸液，在10 倍手術(shù)顯微鏡下應(yīng)用100    m 玻璃筒不銹鋼針頭顯微注射器顯微注入干細(xì)胞懸液于隨機(jī)選擇的大鼠一側(cè)踇長(zhǎng)伸肌上1/3 部肌肉組織中，術(shù)后單籠飼養(yǎng)16 周。16 周后

15、分別測(cè)雙踇長(zhǎng)伸肌肌肉纖顫電波幅度，坐骨神經(jīng)肌纖維神經(jīng)傳導(dǎo)速率后，再次以1戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，分別以4 多聚甲醛和生理鹽水經(jīng)左心室插管灌注，原切口進(jìn)入后游離切取踇長(zhǎng)伸肌，稱濕重后，10 m 片厚冰凍切片并貼片，小鼠抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（CHAT）抗體免疫細(xì)胞化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察拍照，檢測(cè)膽堿酯酶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。    1.4 觀察指標(biāo)    1.4.1 神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成膽堿酯酶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的情況 維甲酸體外誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞后，以MAP2，GFAP

16、0;鑒定誘導(dǎo)分化成神經(jīng)元的比例，再加    入小鼠抗膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（CHAT）抗體雙重標(biāo)記顯示誘導(dǎo)成膽堿酯酶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元比例。    1.4.2 神經(jīng)電生理檢測(cè) 術(shù)后16 周，在麻醉下無菌手術(shù)顯露移植物全長(zhǎng)，用Keypoint 3.02 型便攜式四導(dǎo)程神經(jīng)電生理儀于近端吻合口近側(cè)刺激坐骨神經(jīng)，在踇長(zhǎng)伸肌記錄坐骨神經(jīng)肌纖維神經(jīng)傳導(dǎo)速率及踇長(zhǎng)伸肌肌肉纖顫電波幅度，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行t 檢驗(yàn)。    1

17、.4.3 組織學(xué)檢查 切取踇長(zhǎng)伸肌，稱濕重后，10% 福爾馬林固定的標(biāo)本常規(guī)石臘包埋，行CHAT免疫細(xì)胞熒光染色，觀察膽堿酯酶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量。  2 結(jié) 果    2.1 神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)成膽堿酯酶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的情況    神經(jīng)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元經(jīng)免疫熒光檢測(cè)比例達(dá)到（68.7±5.3）%，誘導(dǎo)分化成膽堿酯酶運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的比例達(dá)(18.9±4.6)%。    2.2

18、60;神經(jīng)電生理檢測(cè)    術(shù)后16 周, 飼養(yǎng)過程中，大鼠死亡1 只，近端吻合口近側(cè)給予電刺激時(shí)，均可在踇長(zhǎng)伸肌記錄到動(dòng)作電位, 實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的肌肉纖顫電波幅度無明顯差異（P  0.05）； 實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組的神經(jīng)肌纖維傳導(dǎo)速度無明顯差異（P  0.05）。    2.3 組織學(xué)檢查    術(shù)后16 周，2 組踇長(zhǎng)伸肌外觀，飽滿度肉眼無明顯差別，標(biāo)本CHA

19、T 免疫細(xì)胞熒光染色，可見實(shí)驗(yàn)組可見膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元陽性細(xì)胞分布，而對(duì)照組則無。    3 討 論    目前國內(nèi)外防治失神經(jīng)肌萎縮的研究主要集中在兩方面：提高神經(jīng)吻合質(zhì)量，加速神經(jīng)的再生。如應(yīng)用顯微外科技術(shù)和細(xì)胞外科技術(shù)修復(fù)損傷神經(jīng)、應(yīng)用神經(jīng)生長(zhǎng)因子來促進(jìn)神經(jīng)再生，縮短神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)時(shí)間。這僅僅是間接防治失神經(jīng)肌萎縮，這對(duì)臂叢、坐骨神經(jīng)、尺神經(jīng)損傷后的肌萎縮難以發(fā)揮作用；阻止和延緩失神經(jīng)肌萎縮的發(fā)生與發(fā)展。主要采用電磁刺激、針灸和藥物治療等方法，通過改善局部的血液循環(huán)來預(yù)防和治療

20、失神經(jīng)肌萎縮，其臨床療效相當(dāng)有限的。也有用各種神經(jīng)營養(yǎng)因子通過局部或全身注射的方法來預(yù)防和治療失神經(jīng)后肌萎縮。但神經(jīng)元對(duì)肌細(xì)胞作用是一個(gè)持續(xù)且長(zhǎng)久的過程，而外源性的神經(jīng)營養(yǎng)因子存在來源有限、生物活性較低、半衰期短、無理想載體、所需濃度較高和不易反復(fù)加入等缺點(diǎn)，影響其效應(yīng)的發(fā)揮。這些方法將電生理和營養(yǎng)因子割裂開來，并由于各自的局限性，療效欠佳。    要想從電生理沖動(dòng)和神經(jīng)源性肌營養(yǎng)因子兩個(gè)方面同時(shí)治療失神經(jīng)肌萎縮，就必須重建神經(jīng)肌連接，失神經(jīng)肌獲得神經(jīng)再支配后肌萎縮緩解，其關(guān)鍵也在于神經(jīng)肌連接。    Crain（

21、1964 年）取橫紋肌組織在體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)由于失神經(jīng)支配，肌組織發(fā)生萎縮；但在培養(yǎng)液中加入脊髓組織，肌萎縮得到明顯改善，并且體外培養(yǎng)的肌組織和脊髓組織可重新建立神經(jīng)肌連接。    近年來，有人將胚胎運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元移植入失神經(jīng)肌肉中，也觀察到運(yùn)動(dòng)終板的形成，肌萎縮減輕。但組織培養(yǎng)神經(jīng)肌連接形成數(shù)量有限，神經(jīng)元移植則存在免疫排斥反應(yīng)較強(qiáng)的缺點(diǎn)。    神經(jīng)干細(xì)胞是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域近10 年來最熱門的研究方向之一?！吧窠?jīng)干細(xì)胞”指的是一群具有自我復(fù)制或自我更新能力的原始細(xì)胞，具有多分化潛能，在特定的因素影響或

22、誘導(dǎo)下，能向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞分化。神經(jīng)干細(xì)胞處于一種較原始的、未分化狀態(tài)，從而不表達(dá)或少表達(dá)個(gè)體所特有的抗原，表現(xiàn)出更低的抗原性，更容易在受體內(nèi)成活。神經(jīng)干細(xì)胞移植后能遷移、分化、整合入宿主組織。已有研究表明神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)多種細(xì)胞因子，    如NGF、PDGF、LIF 等，不僅有神經(jīng)營養(yǎng)因子，也有肌營養(yǎng)作用的因子，如BDNF 等。不同組織來源的神經(jīng)干細(xì)胞更容易分化為相應(yīng)組織中的神經(jīng)細(xì)胞，如人們常用中腦來源的神經(jīng)干細(xì)胞來誘導(dǎo)分化為多表1 術(shù)后16 周各組電生理檢測(cè)結(jié)果組別 坐骨神經(jīng)肌纖維

23、神經(jīng) 肌肉纖顫電波幅度巴胺能神經(jīng)元。神經(jīng)干細(xì)胞移植后的分化不僅與移植前的定向誘導(dǎo)分化培養(yǎng)有關(guān)，更與移植后受體局部微環(huán)境有關(guān)。Galli 等在研究神經(jīng)干細(xì)胞分化潛能時(shí)，將神經(jīng)干細(xì)胞移植到肌組織中，發(fā)現(xiàn)散在的神經(jīng)干細(xì)胞可以分化為肌細(xì)胞并形成肌管，而成簇的細(xì)胞團(tuán)則不分化為肌細(xì)胞。tephen 等4 將神經(jīng)干細(xì)胞移植到橫切斷的坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)斷端，在靶肌組織中觀察到重建神經(jīng)肌連接。以上研究為亟待解決的失神經(jīng)肌肉萎縮防治提供了新的思路，即用神經(jīng)干細(xì)胞移植治療失神經(jīng)肌萎縮。    神經(jīng)生物學(xué)研究證實(shí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及認(rèn)知記憶等功能的神經(jīng)細(xì)

24、胞均與乙酰膽堿有關(guān)，為膽堿能神經(jīng)元，而乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶為Ach 合成酶，也是中樞膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，也可以作為膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志。    本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明胚胎SD 大鼠脊髓神經(jīng)干細(xì)胞在維甲酸誘導(dǎo)下，在體內(nèi)外均能檢測(cè)到膽堿乙?；D(zhuǎn)移酶陽性細(xì)胞，這表明神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)成膽堿能神經(jīng)元，實(shí)驗(yàn)中將其體內(nèi)移植后，具有防治大鼠踇長(zhǎng)伸肌失神經(jīng)肌萎縮的作用，可以達(dá)到和大鼠神經(jīng)損傷修復(fù)后通過神經(jīng)再生營養(yǎng)肌組織相同的效果，另外維甲酸是通過何種信號(hào)途徑誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化為膽堿能神經(jīng)元，還須做進(jìn)一步研究工作。   &#

25、160;本實(shí)驗(yàn)為神經(jīng)干細(xì)胞移植并誘導(dǎo)分化為膽堿能神經(jīng)元，為防治失神經(jīng)肌萎縮提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，由于本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是大鼠，其神經(jīng)再生能力強(qiáng)，到達(dá)運(yùn)動(dòng)終板距離短，這些使本實(shí)驗(yàn)沒能顯示出移植神經(jīng)干細(xì)胞治療失神經(jīng)肌萎縮的優(yōu)勢(shì)。但這對(duì)于今后研究靈長(zhǎng)類動(dòng)物甚至人類預(yù)防失神經(jīng)肌萎縮提供極有價(jià)值的參考?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Modo M, Rezaie P, Heuschling P, et al. Transplantationof neural stem cells 

26、in a rat model of stroke: assessmentof short-term graft survival and acute host immunologicalresponseJ. Brain Res, 2002, 958:70-822 Armstrong RJ, Harrower YP, Hurelbrink CB, et al.