乙型肝炎疫苗加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)因素的研究

1、乙型肝炎疫苗加強(qiáng)免疫誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞免疫應(yīng)答相關(guān)因素的研究    關(guān)鍵詞：乙型肝炎疫苗;細(xì)胞免疫;酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)摘要：目的探討現(xiàn)有乙型肝炎(乙肝)疫苗(hepatitis b vaccine，hepb)在小鼠(h-2d)加強(qiáng)免疫中，不同免疫劑量、免疫時(shí)間及檢測時(shí)間對細(xì)胞免疫檢測的影響。方法采用三種疫苗劑量，兩種加強(qiáng)免疫程序免疫balb/c小鼠，即初次免疫后14d加強(qiáng)免疫和初次免疫后28d加強(qiáng)免疫，分別于加強(qiáng)免疫后7d、14d分離小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell，mnc)，使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunospo

2、t assay.elispot)測定小鼠mnc的干擾素(interferon，ifn)-、白細(xì)胞介素(interleukin，il)-2和il-5斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(spots-forming cell,sfc)。結(jié)果加強(qiáng)免疫后7d，ifn-和il-2的分泌均處于較高水平，而加強(qiáng)免疫后14d檢測時(shí)兩者sfc均出現(xiàn)下降;同時(shí)14d時(shí)可見elispot陽轉(zhuǎn)率也下降，而加強(qiáng)免疫后7d時(shí)陽轉(zhuǎn)率均為100%;14d加強(qiáng)免疫與28d加強(qiáng)免疫程序相比，前者在加強(qiáng)免疫后7d、14d il-2分泌水平均高于后者，在28d加強(qiáng)免疫后7d檢測il-5陽轉(zhuǎn)率均較高，14d時(shí)其陽轉(zhuǎn)率出現(xiàn)下降。結(jié)論hepb在第14d進(jìn)行加強(qiáng)

3、免疫能夠誘導(dǎo)較高的細(xì)胞免疫反應(yīng)，加強(qiáng)免疫后7d可檢測到較高的細(xì)胞免疫反應(yīng)。乙型肝炎(乙肝)病毒(hepatitis b virus，hbv)感染現(xiàn)在仍是全球性的健康問題，全球每年約有100萬人死于與hbv感染相關(guān)的肝病1-2。我國是乙肝高流行地區(qū)之一，乙肝疫苗(hepatits bvaccine，hepb)的應(yīng)用在控制乙肝流行中起了重要作用?，F(xiàn)有的鋁佐劑hepb能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)，高水平的抗體能夠保護(hù)機(jī)體抵抗hbv的急性感染3。而近年來的研究發(fā)現(xiàn)，hepb誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫在母嬰阻斷4、慢性乙肝治療5中可能起著重要作用。通過對hepb加強(qiáng)免疫程序及細(xì)胞免疫檢測時(shí)間的探索，對全面評價(jià)hepb的

4、免疫作用具有一定的意義，同時(shí)本研究結(jié)果能夠?yàn)樾滦蚳epb評價(jià)研究提供一些參考數(shù)據(jù)。材料與方法1hepb重組hepb(漢遜酵母)(hepb medebyrecombinantdeaxyribonucleic acid technigues in hansenula polymorphayeast，hepb-hpy)，由遼寧省大連漢信生物制藥有限公司提供，規(guī)格為10g(微克)/0.5m(l毫升)/支。2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物68周齡balb/c雌鼠，購自中國食品藥品檢定研究院動(dòng)物中心。3實(shí)驗(yàn)程序hepb-hpy稀釋至10g/ml、5g/ml、2.5g/ml，采用背部皮下注射進(jìn)行免疫，每只小鼠劑量為100l。初次

5、免疫后第14d使用相同劑量進(jìn)行加強(qiáng)免疫一次，之后分別于加強(qiáng)免疫后第7d和第14d進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked inmunospot assay，elispot);另一組在初次免疫后28d加強(qiáng)免疫一劑，也于加強(qiáng)免疫后第7d和第14d進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。4elispot實(shí)驗(yàn)免疫后的balb/c小鼠在到期之日頸部脫臼處死，無菌取脾，經(jīng)400目篩網(wǎng)研磨得到脾細(xì)胞懸液;使用nycoprep?淋巴細(xì)胞分離液(挪威axis-shield公司)分離得到脾單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cell，mnc)，使用1640培養(yǎng)基洗滌兩次后，重懸于完全培養(yǎng)基中。經(jīng)不同免疫程序后收集的小鼠脾mnc調(diào)至4&

6、#215;106/ml后，每孔100l加入板中，每孔加入100l乙肝病毒表面抗原(hbv surfaceantigen，hbsag)s28-39肽(序列為：ipqsldswwtsl，終濃度為10g/ml)或80g/ml hbsag作為刺激物，其中干擾素(interferon，ifn)-檢測使用肽刺激，白細(xì)胞介素(interleukin，il)-2和il-5檢測使用hbsag刺激，并設(shè)陰性和陽性對照孔，之后375%co2培養(yǎng)20h(ifn-和il-2)或40h(il-5)。按照elispot試劑盒(美國bd biosciences公司)說明進(jìn)行洗板顯色。使用immunospottm系統(tǒng)(美國ce

7、llular technology公司)對斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(spots-forming cell，sfc)進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果1初次免疫后第14d加強(qiáng)免疫三種不同劑量的hepb在初次免疫后第14d進(jìn)行加強(qiáng)免疫，之后7d、14d采用elispot檢測ifn-il-2的sfc(圖1)。7d時(shí)ifn-、il-2的陽轉(zhuǎn)率均達(dá)100%，但分泌細(xì)胞因子的sfc與劑量反應(yīng)規(guī)律不一。隨著疫苗劑量的下降，ifn-、sfc值降低;il-2的反應(yīng)則在三個(gè)劑量時(shí)均處于較高水平。加強(qiáng)免疫后第14d檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)，ifn-的反應(yīng)較7d時(shí)出現(xiàn)明顯下降，il-2的分泌在較低的兩個(gè)濃度中出現(xiàn)下降，高劑量疫苗組仍維持在較高水平(圖1)。由表

8、1可見，il-2在三個(gè)劑量組中加強(qiáng)免疫后7d和14d陽轉(zhuǎn)率均為100%，ifn-在14d時(shí)陽轉(zhuǎn)率較7d時(shí)為低，最低為20%。2初次免疫后第28d加強(qiáng)免疫在初次免疫后第28d加強(qiáng)免疫，之后分別在第7d和第14d通過elispot檢測細(xì)胞因子分泌水平。圖2顯示：ifn-的反應(yīng)在第7d時(shí)劑量效應(yīng)關(guān)系不明顯，而在第14d檢測時(shí)可見兩個(gè)低劑量組均出現(xiàn)sfc下降;il-2的反應(yīng)在第7d時(shí)以1g劑量組最高，在第14d時(shí)各劑量組結(jié)果相近，無劑量效應(yīng)關(guān)系。從表2中elispot陽轉(zhuǎn)率可見，加強(qiáng)免疫后7d各劑量組均達(dá)到100%陽轉(zhuǎn)，加強(qiáng)免疫后14d檢測時(shí)ifn-elispot陽轉(zhuǎn)率降低至80%，略低于7d時(shí)結(jié)果。

9、在加強(qiáng)免疫后兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)用elispot檢測il-5的分泌水平，由圖3可見，加強(qiáng)免疫后7d隨著疫苗劑量的下降，il-5陽轉(zhuǎn)率逐漸下降;而加強(qiáng)免疫后14d的結(jié)果表明，較高劑量組的il-5陽轉(zhuǎn)率均較7d時(shí)出現(xiàn)下降，僅低劑量組陽轉(zhuǎn)率仍保持在60%。3不同加強(qiáng)免疫時(shí)間及檢測時(shí)間細(xì)胞免疫反應(yīng)的差異在兩種加強(qiáng)免疫時(shí)間條件下均可見，加強(qiáng)免疫后7d檢測的ifn-和il-2細(xì)胞因子sfc值高于14d時(shí)檢測結(jié)果，說明在加強(qiáng)免疫后機(jī)體內(nèi)記憶性免疫反應(yīng)隨著時(shí)間的推移會逐漸下降。對于兩種細(xì)胞因子，在加強(qiáng)免疫后7d檢測結(jié)果進(jìn)行比較可見，初次免疫后第14d加強(qiáng)免疫，其sfc值高于28d加強(qiáng)免疫后結(jié)果;而通過il-5 sfc的

10、陽轉(zhuǎn)率亦可見，加強(qiáng)免疫后7d的反應(yīng)高于加強(qiáng)免疫后14d的反應(yīng)。討論作為預(yù)防性疫苗使用的鋁佐劑重組hepb在控制乙肝的流行及發(fā)病中起了關(guān)鍵性作用。但慢性hbv感染尚無有效的方式完全清除患者體內(nèi)的病毒，現(xiàn)在進(jìn)入臨床研究的多種治療性疫苗，如免疫復(fù)合物疫苗6-7、多肽表位疫苗8-9和核酸類疫苗，在慢性乙肝的治療中提供了多種參考思路，如何誘導(dǎo)慢性乙肝患者細(xì)胞免疫的產(chǎn)生，是這些治療性疫苗的研究重點(diǎn)。而對現(xiàn)有的預(yù)防性疫苗及新型佐劑疫苗的評價(jià)，除了在傳統(tǒng)的抗體水平外，其誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫亦引起人們的關(guān)注。由于至今尚無hbv感染的動(dòng)物模型，臨床前的免疫效果評價(jià)大多基于小鼠實(shí)驗(yàn)。胡忠玉等曾對單劑hepb的劑量效應(yīng)做了

11、一些研究12，而治療性hepb在臨床應(yīng)用中多使用較多劑次的免疫。但發(fā)表的新型hepb論文中，關(guān)于免疫劑量、時(shí)間等因素的影響報(bào)道較少，而在免疫應(yīng)答中抗原的特性、抗原的劑量、抗原進(jìn)入的途徑、免疫時(shí)間及檢測時(shí)間、檢測因子類型等因素對免疫應(yīng)答的結(jié)果都有重要的影響。而特異性t、b細(xì)胞增殖需要反復(fù)接觸抗原，免疫應(yīng)答后期由于抗原量的下降，il-2及其受體的表達(dá)也減少，導(dǎo)致抗原特異性t細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此大部分抗原特異性細(xì)胞隨免疫應(yīng)答的結(jié)束而凋亡，只有一小部分t、b細(xì)胞保留下來成為長期存活的抗原特異性記憶細(xì)胞。本研究中三種不同劑量的疫苗，單只小鼠免疫劑量最高為1.0g，最低為0.25g，在第14d相同劑量加強(qiáng)免

12、疫一劑后7d和14d，elispot檢測ifn-和il-2均發(fā)現(xiàn)，結(jié)果高于第28d進(jìn)行加強(qiáng)免疫的各組。可見初次免疫后加強(qiáng)免疫的時(shí)間延長造成免疫應(yīng)答反應(yīng)的下降。本結(jié)果有助于在疫苗多劑次免疫評價(jià)時(shí)提供免疫時(shí)間方面的參考;在免疫檢測時(shí)間比較中，兩種加強(qiáng)免疫程序、兩種細(xì)胞因子均可見7d時(shí)細(xì)胞因子分泌高于14d時(shí)，可見隨著免疫時(shí)間的增加，機(jī)體內(nèi)記憶性t細(xì)胞減少;而加強(qiáng)免疫之后早期可獲得較好的細(xì)胞免疫反應(yīng)。在兩種加強(qiáng)免疫程序后7d進(jìn)行elispot檢測時(shí)，三個(gè)劑量的疫苗elispot陽轉(zhuǎn)率均達(dá)到100%，可見低劑量的疫苗經(jīng)加強(qiáng)免疫后也可誘導(dǎo)較好的細(xì)胞免疫反應(yīng)。施理等亦發(fā)現(xiàn)，hepb劑量與其誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性t

13、淋巴細(xì)胞(cytotoxic t lymphocyte，ctl)水平及細(xì)胞因子分泌相關(guān)10-11。治療性hepb評價(jià)中一般采用多劑次加強(qiáng)免疫，我們的研究表明，在小鼠中多劑次免疫較少劑量的抗原即可使細(xì)胞免疫反應(yīng)達(dá)100%，且細(xì)胞因子水平隨種類不同規(guī)律亦不同。這提示在較高劑量時(shí)可能出現(xiàn)免疫抑制現(xiàn)象，不利于正確評價(jià)疫苗的免疫效果。同時(shí)對加強(qiáng)免疫后il-5檢測的結(jié)果提示，輔助性t細(xì)胞(helper t lymphocyte，th)2類細(xì)胞因子的分泌規(guī)律與th1類細(xì)胞因子類似，由于其在激活b細(xì)胞中發(fā)揮著作用，il-5的分泌規(guī)律能在一定程度上與疫苗免疫后機(jī)體抗體反應(yīng)的水平有關(guān)。本研究對hepb在小鼠體內(nèi)加強(qiáng)免疫中的免疫劑量、免疫時(shí)間及細(xì)胞免疫檢測時(shí)間進(jìn)行了初