顯微操作在臍血干細胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷中的應(yīng)用

1、顯微操作在臍血干細胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷中的應(yīng)用 作者：尹 文化 ，金大地，魯凱伍，閆慧博，王璐，鄧許勇【摘要】 目的建立大鼠脊髓全橫斷損傷模型， 應(yīng)用 顯微操作方法和人臍血干細胞移植修復(fù)大鼠脊髓損傷，觀察顯微操作技術(shù)對大鼠受損脊髓功能恢復(fù)的影響。方法 取足月健康順產(chǎn)新生兒臍血，分離、培養(yǎng)臍血干細胞。60只SD雌性大鼠，隨機分為假手術(shù)對照組（A組，n=10）、實驗對照組（B組，n10）、常規(guī) 治療 組（C組，n=20）和顯微治療組（D組，n=20）。A組大鼠只打開椎板；B、C組大鼠采用常規(guī)方法行T89平面脊髓全橫斷，造成急性脊髓損傷，C組大鼠于脊髓兩斷端用1 l注射器分別注射臍血干細胞懸液1

2、l（干細胞濃度為6109/L 7109/L），B組同法注射等量PBS液；D組采用顯微操作技術(shù)行脊髓橫斷，并以口徑50 m的毛細玻璃針用相同方法注射臍血干細胞。術(shù)后18周內(nèi)每周進行1次后肢BBB評分，術(shù)后第8周處死大鼠，對比觀察術(shù)中和術(shù)后第8周各組大鼠脊髓大體標(biāo)本外形、顏色、質(zhì)地和體積大小改變。結(jié)果A組大鼠手術(shù)前后運動功能、脊髓大體標(biāo)本未見明顯變化。B、C、D組大鼠術(shù)后雙側(cè)后肢完全性癱瘓，B組大鼠無明顯恢復(fù)。而C、D組大鼠，從術(shù)后第2周開始逐漸恢復(fù)部分后肢運動功能。第3周以后，D組大鼠后肢運動功能BBB評分明顯優(yōu)于C組，具有顯著性差異（P0.05）。術(shù)后第8周，所有大鼠脊髓橫斷處均瘢痕愈合，B組

3、大鼠遠側(cè)段脊髓干癟、皺縮；C組大鼠遠側(cè)段脊髓直徑輕度變細，外形尚飽滿；D組大鼠橫斷處兩側(cè)脊髓直徑無明顯差異，外形圓潤，但局部可見明顯瘢痕粘連。結(jié)論人臍血干細胞移植對脊髓橫斷性損傷具有較好的治療作用，顯微操作技術(shù)的應(yīng)用能最大可能地減少人為造成的脊髓損傷，有利于脊髓損傷的功能修復(fù)。 【關(guān)鍵詞】 顯微操作； 脊髓損傷； 臍血干細胞； 移植 Abstract：ObjectiveTo establish effective and reliable complete spinal cord transection models in rats, and to investigate the effect

4、s of micromanipulation used in surgical procedure of transected spinal cord treated with human umbilical cord blood stem cells (UCBSCs) grafts in rats.MethodHuman UCBSCs were obtained from umbilical cord blood of term deliveries.Sixty SpragueDawley (SD) female rats were divided randomly into group A

5、(control group), group B(spinal cord transection and PBS injection), group C(spinal cord transection and UCBSCs transplantation) and group D(spinal cord transection and UCBSCs transplantation by using micromanipulation).All groups were operated, and 1 l UCBSCs（6109/L 7109/L） were injected into the b

6、oth ends of the completely transected spinal cord at the groups C and D by two different surgical procedures respectively. From 1 week to 8 week postoperation, a behavioral testing was performed weekly upon each hindlimb for all animals according to the BBB scoring system. At the 8th week, all anima

7、ls were sacrificed and the spinal cords were taken out for morphological observation. ResultNo changes were observed at group A pre and postoperation. After 2 weeks postoperation, the hindlimb motor function of groups C and D began to recover. After 3 weeks postoperation, the group D showed more imp

8、rovement than group C, and the difference between groups D and C were significant in the BBB scores(P0.05).No functional recovery was observed at group B. In addition to the adhesion between the spinal dura matter and peripheral tissues at group D, hypertrophic scar existed in the injured spinal cor

9、d of every experimental rat.ConclusionHuman UCBSCs may improve functional recovery of the hindlimbs of the experimental rats. Micromanipulation is benefit to elevating the therapeutic efficacy, because it might minimize the possibility of spinal cord injury in surgical procedure. Key words：micromani

10、pulation; spinal cord injury; umbilical cord blood stem cells; transplantation 脊髓損傷（spinal cord injury, SCI）嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，促進SCI后脊髓神經(jīng)和軸突再生，在一定程度上恢復(fù)雙下肢感覺和運動功能，一直是 醫(yī)學(xué) 界努力的方向。多種干細胞移植治療脊髓損傷的實驗研究已取得一定進展，但療效尚不理想，除卻進一步探索更理想的種子細胞，操作方法的選擇也是影響療效的一個重要因素。人臍血干細胞來源廣泛，具有分化成包括神經(jīng)細胞在內(nèi)的多種 組織 細胞的潛能1、2，有望成為脊髓再生研究中移植細胞的良好替代

11、品，具有較好的應(yīng)用前景。本實驗建立了大鼠完全性脊髓橫斷模型，并對采用不同操作方法治療大鼠脊髓損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)和脊髓大體形態(tài)學(xué)變化進行了對比研究。 1 材料與方法 1.1主要實驗材料 微型不銹鋼薄唇槍鉗（槍頭2 mm1.5 mm，唇厚0.15 mm）、微型神經(jīng)剝離子（寬1 mm、1.5 mm各1把，唇厚0.15 mm）和用上海吉列刀片改制的超薄手術(shù)刀片（刀片厚50 m）由廣州器化醫(yī)療設(shè)備有限公司代為加工制造。顯微鑷和微型自動牽開器購自廣州市金路工貿(mào)有限公司。甲基纖維素5 g/L（美國Sigma公司,），低糖DMEM培養(yǎng)基（Hyclone公司）；FBS（Gibco公司），淋巴細胞分離液（比重1

12、.077 g/ml，天津生物制品研究所）?？谷薈D29、CD34、CD45、CD105、CD106單克隆抗體（深圳晶美公司）, EpicsXL II型流式細胞儀（Beckman Coulter公司）。1 l微量注射器購自上海高鴿工貿(mào)有限公司。毛細玻璃針由南方醫(yī)科大學(xué)生理教研室提供。手術(shù)顯微鏡（云南SSX型），立體定向儀（Narishige SR6），倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡（日本Olympus產(chǎn)品）。實驗主體在南方醫(yī)科大學(xué)生物材料研究所（廣東省重點實驗室）完成。 1.2 實驗動物與分組 雌性SD大鼠由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（許可證號SCXK(粵)200600152006B023）。隨機

13、挑選60只成年雌性健康SD大鼠，體重230270 g，平均（2366.78）g，隨機分成4組，其中A組（n=10）只打開椎板，為假手術(shù)對照組；B組（n=10）行完全性脊髓橫斷PBS斷端注射；C組(n=20)行完全性脊髓橫斷臍血干細胞移植，D組(n=20)在顯微操作下行完全性脊髓橫斷臍血干細胞移植。對死亡大鼠模型，分析死亡原因，并及時予以補足。 1.3 大鼠脊髓全橫斷模型的建立和人臍血干細胞移植 大鼠用100 g/L水合氯醛（300 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)臺上，無菌條件下以T9椎體棘突為中心，縱行切開約2 cm，鈍性分離棘突兩側(cè)椎旁肌達椎板表面，微型自動牽開器牽開兩側(cè)椎旁肌

14、，暴露椎板和椎體棘突，咬除T810椎體棘突。微型神經(jīng)剝離子鈍性分離T810椎間黃韌帶，微型槍鉗咬除T8、9椎板至兩側(cè)關(guān)節(jié)突內(nèi)緣?？v行剖開硬脊膜約0.5 cm，經(jīng)硬脊膜切口，于硬脊膜下蛛網(wǎng)膜外，將超薄手術(shù)刀片抵在一側(cè)骨壁上，劃斷脊髓，包括脊髓背靜脈、兩側(cè)的脊髓背動脈和脊髓腹動脈，避免反復(fù)切割。選擇健康足月產(chǎn)婦，待新生兒娩出后，按照Wang等3的方法備取第3代臍血干細胞，在立體定位儀下用1 l微量注射器行細胞移植。D組大鼠采用毛細玻璃針行細胞移植，其硬脊膜切口采用顯微縫合。其余各組大鼠背側(cè)硬脊膜切口用胸背部筋膜片覆蓋，常規(guī)分層縫合。術(shù)后連續(xù)3 d每日予青霉素（3萬IU/kg）肌注1次。每籠飼養(yǎng)45

15、只大鼠，恒溫保暖，隔日更換墊料。每日行人工膀胱按摩排尿，早晚各1次。D組顯微操作在10倍手術(shù)顯微鏡下完成。 1.4 脊髓形態(tài)學(xué)觀察及后肢運動功能評價 術(shù)中觀察各組大鼠脊髓形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。從術(shù)后第1周開始，對大鼠進行BBB評分4，每周1次，每次持續(xù)觀察4 min或來回爬行5個輪回，取平均分，直至術(shù)后8周。沒有額外的引誘或促動因素。評分者為非本組實驗人員且熟知BBB 評分標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后第8周，過量麻醉處死大鼠，經(jīng)心臟灌注固定脊髓，觀察其形態(tài)、顏色、質(zhì)地、體積大小及局部粘連情況，并與術(shù)中情況進行對比。 1.5 統(tǒng)計 學(xué)數(shù)據(jù)處理 所有計量資料均以s表示，應(yīng)用SPSS 12.0 軟件 包進行統(tǒng)計學(xué)處理，組間比

16、較用OneWay ANOVA檢驗，組內(nèi)比較用t檢驗。 P0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2 結(jié)果 2.1 人臍血干細胞分離、體外培養(yǎng)及免疫鑒定 共采集36份新鮮臍血，每份臍血平均采集量為25.94 ml(2089 ml),臍血干細胞分離后，用苔盼藍拒染法測定細胞活力。Olympus相差顯微鏡觀察細胞并計數(shù)，可見少許死亡細胞呈深藍色，絕大多數(shù)細胞拒染，呈明亮圓球狀，活細胞百分比為（98%0.71%）。細胞計數(shù)板計數(shù)，分離后每份臍血干細胞計數(shù)為（1.450.14）109/L。按Wang等3的方法體外純化培養(yǎng)臍血干細胞，取第3代臍血干細胞，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原結(jié)果表明，人臍血干細胞不表達或弱

17、表達CD34、CD45、CD106等造血干細胞和內(nèi)皮細胞標(biāo)志，但是顯著高表達CD29、CD105等間充質(zhì)干細胞表面抗原標(biāo)志。 2.2 大鼠術(shù)后情況及后肢運動功能評價 A組大鼠術(shù)后全部存活，術(shù)前、術(shù)后BBB評分無明顯變化。B、C、D組大鼠術(shù)后均表現(xiàn)為雙側(cè)后肢完全性遲緩性癱瘓，B、C組大鼠分別死亡2、3例（均因術(shù)后尿道梗阻致膀胱破裂），D組死亡2例（其中1例為術(shù)后第9 d因大便梗阻致死；另1例為尿道寄生蟲梗阻，膀胱破裂致死），B、C、D組死亡率分別為20、15、10%。并發(fā)單側(cè)后肢褥瘡3例（B組2例，D組1例），并發(fā)單側(cè)下腹部褥瘡2例（C、D組各1例），經(jīng)積極創(chuàng)面護理后愈合。術(shù)后第2周，C、D組大

18、鼠逐漸恢復(fù)部分后肢運動功能，D組大鼠后肢開始出現(xiàn)關(guān)節(jié)活動，并逐步出現(xiàn)下肢無承重劃動、足背承重。從術(shù)后第3周開始，D組大鼠后肢運動功能恢復(fù)較快，BBB評分明顯優(yōu)于C組，開始出現(xiàn)后肢部分承重，并且后肢爪的功能出現(xiàn)不同程度的恢復(fù)，差異具有顯著性意義（P0.05）。術(shù)后56周，C、D組大鼠后肢功能恢復(fù)進入平臺期（表1）。 表1 術(shù)后各組大鼠后肢神經(jīng)功能BBB評分結(jié)果比較 D組與C組比較，*P 0.05； *P 0.01 2.3 大鼠術(shù)中和術(shù)后第8周脊髓形態(tài)學(xué)觀察 A組大鼠硬脊膜完整，術(shù)中與術(shù)后相比脊髓未見明顯變化，僅見硬脊膜與周圍 組織 輕度粘連。D組采用顯微操作，術(shù)中脊髓背靜脈清晰可見（圖1b），硬

19、脊膜保存完好（圖2c），行脊髓橫斷和臍血干細胞移植后兩斷端光整，外形飽滿，術(shù)野清晰（圖2d）；而B組和C組未采用顯微操作，術(shù)中可見脊髓背靜脈和硬脊膜毛細血管充血明顯（圖1a）。行脊髓橫斷后，B、C兩組分別行PBS注射和臍血干細胞移植，術(shù)中可見橫斷處兩側(cè)脊髓部分塌陷、水腫、變形，脊髓殘端參差不齊，部分大鼠可見脊髓組織水腫、膨出（圖2a、2b）。術(shù)后第8周，所有實驗大鼠脊髓橫斷處均瘢痕愈合，局部與周圍組織粘連，以D組更為顯著，分離困難；B組大鼠橫斷處遠側(cè)段脊髓明顯萎縮、干癟，直徑變細（圖3a）；C組大鼠橫斷處遠側(cè)段脊髓直徑稍變細，但外形尚圓潤、飽滿(圖3b)；D組橫斷處瘢痕增生范圍最窄，兩側(cè)脊髓直

20、徑、外形、色澤無明顯差異（圖3c）。 3 討 論 干細胞移植 治療 脊髓損傷作為一種新的生物治療手段，能夠在一定程度上直接為病灶區(qū)補充神經(jīng)元和神經(jīng)間質(zhì)細胞，促進殘存神經(jīng)細胞和軸突的存活與再生5，因而受到越來越多的關(guān)注。但是，目前已研究的干細胞，例如骨髓間充質(zhì)干細胞、神經(jīng)干細胞、胚胎干細胞、脂肪干細胞等5、6，或因為取材來源受限，或存在倫 理學(xué) 等問題，使相關(guān)基礎(chǔ)研究和 臨床 應(yīng)用 受到限制。人臍血來源豐富，研究表明，在不同實驗條件下，人臍血干細胞具有向包括神經(jīng)細胞在內(nèi)的各胚層細胞分化的潛能1、2，加之取材安全，操作簡單，容易被孕婦及其家屬所接受，無倫理學(xué)等問題，有望成為神經(jīng)再生研究中移植干細胞

21、的良好替代品7、8。作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，脊髓損傷（SCI）的治療目前仍限于保守支持治療，雖然有應(yīng)用干細胞治療脊髓損傷的相關(guān)研究報道，但是效果尚不理想，其中存在的問題之一就是目前實驗研究均未能有效突破神經(jīng)再生的主要屏障膠質(zhì)瘢痕9。已有的SCI模型包括脊髓半切模型、全橫斷模型或脊髓打擊模型等10，由于造模方法和操作的差異，難以對影響膠質(zhì)瘢痕形成的原因、以及脊髓神經(jīng)和軸突再生通過膠質(zhì)瘢痕的能力進行量化評估，造成對治療效果的評估困難。針對該問題，本實驗對造模方法進行了一些改進：采用顯微操作技術(shù)，在保證脊髓全橫斷的前提下，盡可能的減少操作中人為造成的對脊髓殘端及殘存神經(jīng)纖維的損傷，從而盡可

22、能的減輕神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成和縮小膠質(zhì)瘢痕的厚度，為神經(jīng)纖維和軸突再生通過膠質(zhì)瘢痕區(qū)創(chuàng)造條件。 本實驗組觀察發(fā)現(xiàn)，在人臍血干細胞移植后的C、D組中，D組由于采用了顯微操作技術(shù)，術(shù)中操作精細，對硬脊膜和脊髓的干擾和損傷少，術(shù)中脊髓背靜脈清晰可見，結(jié)構(gòu)清楚，硬脊膜保存完好；而未采用顯微操作的C組，則可見脊髓背靜脈和硬脊膜毛細血管網(wǎng)明顯充血、擴張。同樣，行臍血干細胞移植后，采用顯微操作技術(shù)的D組脊髓兩端齊整，橫斷間隙均勻，術(shù)野清晰，脊髓殘端外形飽滿、輪廓清楚；而C組脊髓殘端則明顯水腫、膨隆，部分橫斷間隙被膨出的脊髓組織所充填。在術(shù)后第8周，D組脊髓標(biāo)本外形飽滿，色澤乳白，直徑均勻，橫斷處瘢痕組織增生非

23、常局限；與此形成鮮明對照的是，C組脊髓標(biāo)本可見長段瘢痕增生區(qū)，局部脊髓表面粗糙、外形粗細不均，而且遠側(cè)段脊髓直徑也有所變細。由此可見，顯微操作技術(shù)的應(yīng)用，不但減少了操作過程中不可避免的對脊髓的人為損傷，而且減輕了膠質(zhì)瘢痕的形成和膠質(zhì)瘢痕的厚度。與此相一致，從術(shù)后第3周開始，雖然C、D組大鼠雙側(cè)后肢運動功能均逐步恢復(fù)，但是D組大鼠恢復(fù)的速度和程度明顯優(yōu)于C組，具有 統(tǒng)計 學(xué)意義（P0.05）。這表明顯微操作技術(shù)的應(yīng)用，為神經(jīng)和軸突再生通過脊髓損傷區(qū)創(chuàng)造了條件，從而能夠在一定程度上促進和提高脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)，提高了治療效果。 研究表明7，將人臍血干細胞植入大鼠腦內(nèi)，移植細胞能夠分化為神經(jīng)膠質(zhì)細胞

24、和神經(jīng)元。Willing等8將人臍血干細胞移植入成年大鼠局灶性腦缺血灶內(nèi)24 h后，觀察到成年大鼠記憶功能的改善。在本實驗中，與采用人臍血干細胞移植治療的C、D兩組相比，雖然B組術(shù)中所見與臍血干細胞移植治療的C組相似，但是，術(shù)后B組大鼠雙側(cè)后肢運動功能始終未見恢復(fù)，而且術(shù)后第8周，B組大鼠脊髓標(biāo)本橫斷處兩側(cè)直徑差異顯著，遠側(cè)段脊髓明顯萎縮、干癟，直徑變細，外形輪廓不規(guī)則。這表明，臍血干細胞移植對脊髓損傷有較好的治療作用，但是其具體作用機制目前尚不完全清楚，有待進一步深入研究。 圖1a 普通操作致脊髓背靜脈和硬脊膜毛細血管網(wǎng)明顯充血、擴張 圖1b 采用顯微操作的D組，脊髓背靜脈清晰可見，硬脊膜毛

25、細血管無充血 圖2a B組大鼠脊髓橫斷+PBS殘端注射后，橫斷處被水腫、膨出的殘端脊髓組織充填 圖2b C組行脊髓橫斷+臍血干細胞移植后，橫斷處兩側(cè)部分脊髓塌陷 圖2c、2d D組采用顯微操作行脊髓橫斷+臍血干細胞移植后，硬脊膜保存完好，脊髓殘端整齊、結(jié)構(gòu)清楚，橫斷間隙均勻 圖3 術(shù)后第8周脊髓大體形態(tài)學(xué)比較 圖3a B組大鼠脊髓橫斷處毀損嚴(yán)重，局部可見長段瘢痕組織增生，遠側(cè)段脊髓明顯萎縮外形干癟,直徑變細 圖3b C組大鼠脊髓橫斷處亦可見長段瘢痕增生，遠側(cè)段脊髓直徑稍變細，但外形飽滿、圓潤 圖3c D組大鼠脊髓橫斷處局限性瘢痕組織增生，橫斷處兩側(cè)脊髓直徑，外形無明顯差別 綜上所述，本實驗成功

26、建立了脊髓完全性橫斷大鼠模型，在臍血干細胞移植治療脊髓損傷的同時，采用顯微操作技術(shù)明顯提高了受損脊髓的神經(jīng)功能恢復(fù)。隨著對臍血干細胞移植修復(fù)機制的深入研究和移植治療方法的不斷改進，相信顯微操作技術(shù)必將在神經(jīng)損傷性疾病的治療中發(fā)揮更大的作用?！?參考 文獻 】 1 Romanov YA,Svintsitskaya VA,Smimov VN.Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells:candidate MSClike cells from umbilical cordJ.Stem Cell

27、s,2003,1:105-110.2 Walczak P,Chen N,Eve D,et al.Longterm cultured human umbilical cord neurallike cells transplanted into the striatum of NOD SCID miceJ.Brain Research Bulletin,2007,74:155-163.3 Wang TT, Tio M, Lee W,et al.Neural differentiation of mesenchymallike stem cells from cord blood is mediated