實驗一 食品中大腸菌群的測定

1、大腸菌群(M.R.N.)的測定一、實驗?zāi)康模?（1）了解大腸菌群在食品衛(wèi)生檢驗中的意義   （2）學習并掌握大腸菌群的檢驗原理和方法，以判別食品的衛(wèi)生質(zhì)量  二、實驗原理：大腸菌群系指一群能在37經(jīng)24h能發(fā)酵乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。它反映了食品是否被糞便污染，同時間接地指出食品是否有腸道致病菌污染的可能性。 食品中大腸菌群數(shù)系以每100g（或ml）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（the most probable numb

2、er-簡稱MPN）表示。 最近似數(shù)（most probable number-簡稱MPN）法是一種將樣品“多次（管）稀釋至無菌”的計數(shù)方法。將3個稀釋梯度的檢樣稀釋液接種于9支或15支試管培養(yǎng)基中，每個稀釋度接種3支或5支。經(jīng)培養(yǎng)后，根據(jù)結(jié)果查閱MPN檢索表，就可得到原樣品中微生物的估計數(shù)量。MPN測定方法尤其適用于帶菌量極少、其他方法不能檢測的食品。如水、乳制品及其他食品中大腸菌群的計數(shù)。三、材料1、樣品乳、肉、禽蛋制品、飲料、糕點、發(fā)酵調(diào)味品或其他食品。 2、菌種大腸埃希氏菌（Escherichia coli）產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacteria aero

3、genes）3、培養(yǎng)基及試劑單料乳糖膽鹽發(fā)酵管、雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管、乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍瓊脂（EMB）、革蘭氏染色液、蛋白陳水、靛基質(zhì)試劑、麥康凱(MA)4、其它設(shè)備和材料 溫箱(36土1)、水浴鍋(44土0.5)、天平、顯微鏡、均質(zhì)器或乳缽、溫度計、平皿、試管、發(fā)酵管、吸管、載玻片、接種針。四、實驗步驟(一)檢驗程序大腸菌群檢驗程序見圖(二)操作步驟1采樣及稀釋（具體材料）以無菌操作鮮橙多飲料（具體根據(jù)實驗室提供的確定）25g(或25mL)放于含有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)(瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠)或滅菌乳缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最

4、好用無菌均質(zhì)器，以8000rmjn10000rmin的速度處理1min，做成1：10的稀釋液。用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1mL，注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作10倍遞增稀釋液。根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗樣品污染情況的估計,選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。2乳糖初發(fā)酵試驗即通常所說的假定試驗。其目的在于檢查樣品中有無發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體的細菌。將待校樣品接種子乳糖服鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管1mL及1mL以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一個稀釋度接種3管，

5、置(36土1)培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)(24土2)h，的所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程序進行。如有產(chǎn)生者，則按下列程序進行。3分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍瓊脂板，置(36土1)溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h24h，：然后取出，觀察菌落形態(tài)并作革蘭氏染色鏡檢和復發(fā)酵試驗。4乳糖復發(fā)酵試驗即通常所說的證實試驗，其目的在于證明從乳糖初酪管試驗呈陽性反應(yīng)的試管內(nèi)分離到的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，確能發(fā)酵乳糖產(chǎn)生氣體。在上述的選擇性培養(yǎng)基上，挑取可疑大腸菌群12個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置(36士l)的溫箱內(nèi)培養(yǎng)(24土2)h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖發(fā)酵管產(chǎn)氣革蘭

6、氏染色為陰性反應(yīng)的無芽胞桿菌，即報告為大腸桿菌陽性；凡糖發(fā)酵管不產(chǎn)氣或革蘭氏染色為陽性，則報告為大腸桿菌為陰性。5報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表(見表54)，報告每100mL(8)食品中大腸菌群的最可能數(shù)。5.1試驗結(jié)果表 接種量管號 發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果有無典型菌落革蘭氏染色結(jié)果復發(fā)酵反應(yīng)結(jié)果最后結(jié)論 +或-0.1ml1230.01ml1230.001ml123注：填寫初發(fā)酵與復發(fā)酵結(jié)果應(yīng)以下列符號表示?！?”表示不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基為紫色；“+”表示只產(chǎn)酸而不產(chǎn)氣，培養(yǎng)基變黃色；“”表示產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，培養(yǎng)基變黃，并有氣泡。5.2 結(jié)果報告 根據(jù)證實大腸菌群的陽

7、性管數(shù),查MPN檢索表(見附錄)報告每100ml(克)大腸菌群的最可能數(shù).6.附件1g檢樣中最近似值(MPN)表使用三管法，接種量分別為0.1，0.01和0.00lg。大腸菌群MPN檢索表陽性管數(shù)MPN95%可信限1ml（g）×30.1ml（g）×30.01ml（g）×3100 ml（g）下限上限0000000001233030609059000001111012330609012051300000222201236090120160000033330123901301601901111000001234070110150510200210111111110123

8、701101501901030230360111122220123110150200240303601111333301231602002402902222000001239014020026010303603702222111101231502002703403070440890222222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000 注：本表采用3個稀釋度0.1g(mL)、0.0lg(mL)和0.001g(mL)，每個稀釋度接種3管。表內(nèi)所列檢樣量如改用1g(mL)、0.10(mL)和0.01g(mL)時，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)降低10倍：如改用0.01g(mL)、0.001g(mL)和0.0001g(mL)時，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相