單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失重組質(zhì)粒的構(gòu)建及序列分析

1、    單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因部分缺失 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及序列分析        關(guān)鍵詞：單純皰疹病毒胸苷激酶基因缺失突變序列分析摘要：目的：構(gòu)建HSV-1型胸苷激酶基因部分缺失的重組質(zhì)粒并進行序列測定。方法：以pUC18/TK重組質(zhì)粒DNA為模板，用PCR方法擴增TK5端503bp基因片段，并將擴增的片段克隆入載體pUC18中(pUC18/TK1)；用PstI和Hind雙酶切pUC18/TK，獲得TK3端383bp片段，將此酶切片段克隆入pUC18/TK1中，

2、并進行測序。結(jié)果：構(gòu)建成重組質(zhì)粒pUC18/TK。經(jīng)酶切鑒定獲得1條約900bp的基因片段；序列測定證實,HSV-1 17synTK基因缺失了第493744位251對堿基。結(jié)論：成功地構(gòu)建了部分缺失的HSV-1/TK基因重組質(zhì)粒，為研制其突變株奠定了基礎(chǔ)。中國書資料分類號：Q78R373.11Construction and seguencing recombinat plasmid of the thymidine kinase gene deletion mutation of herpes smplex virus type IZhen Rongfen, Yu Qigui, Chen W

3、ei， Fan Rong, Xue Caifang (Laboratory of Anti? infectious Diseases,the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032) Keywords：herpes simplex virus thymidine kinase deletion mutation seguencing mutation Abstract：Aim:Constructing and seguencing recombinated plasmid of the thymidine kinase gene

4、 deletion mutation of herpes smplex virus type I (HSV-1). Methods: The 5-TK 503bp was amplified by PCR. And the TK genic DNA of HSV-1 17syn strain in the recombinated plasmid pUC18(pUC18/TK) was used as tamplate. The amplified fragment was cloned into pUC18 vector（ pUC18/TK1）. Then the pUC18/TK was

5、cleaved with both pst I and Hind III enzymes. The 3-TK 383bp fragment was obtained and cloned into plasmid pUC18/TK1. It's sequence was analysed. Results:The recombination plasmid pUC18/TK was constructed. The 251 bp from location 493 to 744 of TK gene of HSV-1 17syn strain was deleted in the pl

6、asmid pUC18/TK . The other part of the sequence did not vary. Conclusion:The recombinated plasmid of HSV-1/TK in which part genome was delected was successfully constructed.The plasmid pUC18/TK laid a good fundation for further constructing TK deletion mutant of HSV-1. 單純皰疹病毒I型（herpes simplex virus

7、type I,HSV-I）的胸苷激酶(thymidine kinase,TK)基因為其早期基因,若發(fā)生突變則形成突變株tk()HSV-I,能在鼠三叉神經(jīng)節(jié)細胞等非分裂細胞中建立潛伏感染，但不能激活1，故對正常神經(jīng)細胞無破壞作用。但tk()HSV-I能感染分裂細胞(如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞和視網(wǎng)膜瘤細胞等)，并能在這些細胞中增殖，使之溶解破壞2。體外研究表明，tk()HSV-I突變株可殺傷U87和L19等神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞3,4。經(jīng)皮下、腎包膜下及顱內(nèi)右前葉直接注射tk()HSV-I突變株于荷神經(jīng)膠質(zhì)瘤的裸鼠及具有免疫活性的大鼠體內(nèi)，可使腫瘤組織發(fā)生壞死，但不破壞正常組織。因此,本研究擬構(gòu)建部分缺失的HSV

8、-1/TK基因重組質(zhì)粒,以為進一步構(gòu)建TK基因部分缺失的重組HSV-1突變株奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1質(zhì)粒重組質(zhì)粒pUC18/TK(含HSV-1 17syn株TK基因的全部編碼區(qū)序列),由本室構(gòu)建5。1.2引物通過計算機輔助分析，根據(jù)HSV-1 17synTK基因序列，在其5端設(shè)計一段引物（引物1），引入EcoRI酶切位點；根據(jù)HSV-1 17synTK基因第468492位堿基序列，設(shè)計一段反向引物（引物2）,并引入PstI酶切位點。引物由美國OperonTechnologies公司合成。其序列如：引物1:For:5-CGGAATTCATGGCTTCGTACCCCTGCCATCA-3引物2:

9、Rev:5-TACTGCAGATGGCGGTCGAAGATGAGGGTGA-31.3質(zhì)粒的提取、酶切、連接及轉(zhuǎn)錄主要方法均參照分子克隆一書進行。1.4HSV-1 17synTK基因部分序列（503bp）重組質(zhì)粒的構(gòu)建PCR反應(yīng)體系：模板為本室構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC18/TK600ng,引物1For和引物2Rev各1mol/L，4種dNTP各200 mol/L，3mmol/LMgCl2,5 l10×PCR緩沖液，總體積501。PCR反應(yīng)液經(jīng)100煮沸變性5min后，每管加入Taq聚合酶0.8U,以201液體石蠟油封面后，進行PCR擴增：即941min,601min,72延伸90s,共35

10、個循環(huán)。然后于72延伸10min。PCR產(chǎn)物在含0.5mg/L溴化乙錠(EB)的10g/L瓊脂糖凝膠中電泳,在紫外燈下觀察結(jié)果。經(jīng)10g/L低熔點瓊脂糖凝膠電泳回收503bp片段。用SurePure DNA Extraction Kit(Embi Tec公司產(chǎn)品)純化回收的DNA片段。經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切后,克隆入經(jīng)相應(yīng)酶切后制備的pUC18載體中,轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109細菌。將得到的陽性克隆，經(jīng)PCR及EcoR I和Pst I雙酶切鑒定，命名為pUC18/TK1重組質(zhì)粒。1.5HSV-1TK基因部分缺失重組質(zhì)粒的構(gòu)建用Pst I和Hind III雙酶切pUC18/TK重組質(zhì)粒，回收

11、TK3端383bp的片段；克隆入用同種酶切消化的pUC18/TK1中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109細菌，將得到的陽性克隆，經(jīng)PCR及EcoR I和Hind III雙酶切鑒定，命名為pUC18/TK重組質(zhì)粒（1）。1pUC18/TK重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig 1 Construction of recombinat plasmid pUC18/TK1.6pUC18/TK序列的測定pUC18/TK重組質(zhì)粒經(jīng)用QIAGEN公司產(chǎn)品QIAamp Tip25-Kit純化后，由美國夏威夷大學生物中心Neil博士在Applied Biosystems Model 373A Version全自動序分析儀中進行5測序。2結(jié)果

12、2.1pUC18/TK1重組質(zhì)粒DNA的鑒定用引物1For和引物2Rev，對pUC18/TK重質(zhì)粒進行擴增。將擴增產(chǎn)物克隆入pUC18載體中，經(jīng)轉(zhuǎn)化得到的陽性克隆，用EcoR I及Pst I雙酶切和PCR鑒定，獲得預(yù)期的503bp基因片段（2）。2重組pUC18/TK1的PCR鑒定Fig 2 Identification of the recombinant plasmid pUC18/TK1 by PCR 1,2,3 and 5: Positive colonies;4 and 9: DNA molecular weight markers;6 and 7: Negative colonie

13、s 2.2pUC18/TK重組質(zhì)粒DNA的鑒定將構(gòu)建的pUC18/TK重組質(zhì)粒，用EcoR I和Hind III雙酶切消化及PCR擴增鑒定，得到1條預(yù)期約900bp的基因片段(3)。3重組pUC18/TK質(zhì)粒的酶切鑒定Fig 3 Identification of the recombinant pUC18/TK plasmid with EcoRI and Hind III1:Negative control; 2:DNA molecular weight makers; 3,4,5,6 and 7:Positive colonies 2.3pUC18/TK重組質(zhì)粒DNA的序列測定序列測定的

14、結(jié)果顯示,pUC18/TK重組質(zhì)粒DNA缺失了HSV-117Syn株TK基因第493744位251對堿基序列，其余基因序列相同。缺失后的TK基因序列約為900bp（4）。4pUC18/TK重組質(zhì)粒的DNA序列Fig 4 Nucleotide sequence of the recombinant plasmid pUC18/TKDotted line shows deletion of nucleotide sequence 3討論TK基因是腫瘤基因治療中應(yīng)用最多、最重要的藥物敏感靶基因之一。將HSV-1TK基因克隆入腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，經(jīng)包裝細胞包裝成對快速分裂的細胞具有感染性的重組病

15、毒，將其感染腫瘤病毒細胞，使TK基因與腫瘤細胞基因組DNA整合，便可成為抗皰疹病毒核苷類藥物(如無環(huán)鳥苷和丙氧鳥苷等)的靶基因，達到殺傷腫瘤細胞的目的。將TK基因去除一小段克隆入載體中，與野生型HSV-1TK基因組DNA在活細胞內(nèi)重組后，可篩選出HSV-1TK基因部分缺失的突變株，這種突變株不能在正常神經(jīng)膠質(zhì)細胞中增殖，但能在膠質(zhì)細胞瘤細胞等快速分裂的神經(jīng)細胞中增殖并使之溶解破壞，因而可用重組的HSV-1TK基因部分缺失的突變株治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腦部的惡性腫瘤。本研究采用生物工程技術(shù)，將HSV-117synTK基因的5端503bp片段與3端383bp片段連接，構(gòu)建成缺失第493744位251對堿

16、基序列的TK基因載體，為構(gòu)建TK基因部分缺失的重組HSV-1突變株，治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤等腦部惡性腫瘤奠定了基礎(chǔ)。*?國家自然科學基金資助項目，NO.39570807作者簡介：甄榮芬，女，52歲，副教授。西安市長樂西路17號,Tel(029)3374536作者單位：第四軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部抗感染研究室，西安，710032參考文獻1Coen DM, Kosz-Vnenchak M, Jacobson JG, et al.Thymidine kinase-negative herpes simpex virus mutants establish lantency in mouse trigeminal bu

17、t do not reactivate. Proc Natl Acad Sci USA,1989;86(12):47364740 2Robert LM, Amy M, James MM, et al. Exprimental therapy of human glioma by means of a genetically engineered virus mutant. Sience,1991; 252(5007):854856 3James MM, Amy M, Donald MC. Reduction and elimination of encephalitis in an experimental glioma therapy model with attenuated herpes simplex mutants that retain susceptibility to acyclovir. Neurosurgery.1993; 32(4):5