苯安莎類抗生素的一種早期鑒別方法

1、苯安莎類抗生素的一種早期鑒別方法         09-08-27 08:51:00     編輯：studa20             作者：劉愛明 武臨專 王以光 張會(huì)圖 赫衛(wèi)清 李永海 張侃【摘要】  目的 建立一種對(duì)苯安莎類抗生素特異的顏色反應(yīng)早期鑒別方法。方法 根據(jù)堿性處理苯安莎類抗生素，使其安莎鏈與苯環(huán)連接的酰胺鍵開裂后化合

2、物呈紫色的原理，建立了將發(fā)酵液粗提品進(jìn)行薄層色譜層析后采用2.0mol/L NaOH溶液噴涂顯色的早期鑒別方法；以格爾德霉素為例，在硅膠板上的檢測(cè)靈敏度為4g。結(jié)論 采用該顏色鑒別反應(yīng)方法：對(duì)兩株確證為新的格爾德霉素產(chǎn)生菌Streptomyces sp. 44以及Streptomyces sp. 357進(jìn)行了佐證；對(duì)吸水鏈霉菌Streptomyces hygroscopicus 17997的一株格爾德霉素生物合成后修飾基因阻斷變株CT1中產(chǎn)生的格爾德霉素前體物及其類似物，在硅膠板上進(jìn)行了快速定位和初步鑒別。 【關(guān)鍵詞】  苯安莎類抗生素； 酰胺鍵； 顏色反應(yīng)； 鑒別 

3、60;  ABSTRACT  Objective  Establishing a simple and sensitive method for early preliminary discrimination of benzenic ansamycins and their derivatives.  Method  Most natural benzenic ansamycins are yellow compounds, some are white or colorless compounds. After treatment of a

4、lkali such as NaOH or sodium methoxide, which breaks the amide bond formed between the benzenic aminogroup and the ansabridges terminal carboxygroup, benzenic ansamycins such as geldanamycin changed its color from yellow to purple. The minimal detection limit of this method on the silica gel plate f

5、or geldanamycin was 4g with NaOH (2.0mol/L) sprayed. Results  This color change reaction method was used successfully for early preliminary discrimination of geldanamycin produced by two soilisolated novel strains, Streptomyces sp. 44 and Streptomyces sp. 357, with ansamycin producing potential

6、(s), and fast location and preliminary discrimination on silica gel plate of geldanamycin derivatives produced by CT1, a mutant strain of Streptomyces hygroscopicus 17997 with one of the geldanamycin biosynthetic tailoring genes being disrupted. 安莎類抗生素具有重要的生物學(xué)活性，例如，利福霉素是目前臨床上最重要的抗結(jié)核病藥物之一；格爾德霉素(gelda

7、namycin)具有抗腫瘤和抗病毒活性等。安莎類抗生素還具有抗細(xì)菌(革蘭陽(yáng)性菌)、抗霉、抗酵母和抗原蟲等活性。因此，安莎類抗生素日益受到人們的重視。    安莎類抗生素為一個(gè)脂肪鏈(稱為安莎橋)連接于芳香環(huán)的兩個(gè)不相鄰原子間的一類化合物，其中的芳香環(huán)有苯環(huán)和萘環(huán)兩種，所以安莎類抗生素可以分為苯安莎類抗生素(例如格爾德霉素)和萘安莎類抗生素(例如利福霉素)兩種。在已知的安莎類抗生素中，無(wú)論是苯安莎類抗生素還是萘安莎類抗生素，其安莎橋的一端均通過(guò)酰胺鍵與芳香環(huán)相連(迄今唯有萘安莎類抗生素紅迪菌素例外，其酰胺鍵上的羰基被進(jìn)一步還原)。   

8、 在微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物篩選的過(guò)程中，陸續(xù)有安莎類抗生素被發(fā)現(xiàn)的報(bào)道。例如，GlaxoWellcome公司的Stead等1在篩選抗制癌蛋白M抑制劑的過(guò)程中從一株鏈霉菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了一組格爾德霉素類似物，日本的Hosokawa等2，3在篩選腫瘤細(xì)胞系的生長(zhǎng)抑制劑中獲得了噻唑三烯霉素(thiazinotrienomycins)，Kakeya等4在篩選白血病細(xì)胞系IL60的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑中得到了胞三烯菌素A(cytotrienin A)。除莠霉素和格爾德霉素都是較早發(fā)現(xiàn)的苯安莎類抗生素，具有除草、抗菌、抗腫瘤和抗病毒等活性；格爾德霉素由于其優(yōu)越的抗腫瘤活性，目前受到重視；在國(guó)內(nèi)，胡海峰5、朱寶

9、泉6等在免疫抑制劑的篩選過(guò)程中獲得了除莠霉素A及其產(chǎn)生菌和格爾德霉素及其產(chǎn)生菌。但是至今還沒有見到有關(guān)安莎類抗生素早期鑒別方法的報(bào)道。    本文作者所在實(shí)驗(yàn)室根據(jù)安莎類抗生素的生物合成原理，建立了一種專門針對(duì)安莎類抗生素產(chǎn)生菌的分子篩選模型。從土壤分離的約1900株未知放線菌中篩選得到了一批具有產(chǎn)生安莎類抗生素潛能的放線菌7，這些菌株的發(fā)酵產(chǎn)物絕大多數(shù)具有抗菌、抗病毒或抗腫瘤活性。如何從這些陽(yáng)性菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中快速、準(zhǔn)確地鑒別安莎類抗生素，顯得特別重要和迫切。    多數(shù)安莎類抗生素具有顏色(多為黃色)，安莎橋中含有三烯鍵的安莎類抗

10、生素具有特征性的紫外吸收峰(268、278和290nm)；這些性質(zhì)對(duì)于鑒別安莎類抗生素有一定幫助，但不能夠作為比較可靠的、早期鑒別安莎類抗生素的方法。安莎類抗生素的分子結(jié)構(gòu)中，安莎橋的一端通過(guò)酰胺鍵與芳香環(huán)相連。Schnur等8利用甲醇鈉(一種強(qiáng)堿)使格爾德霉素的酰胺鍵開裂，產(chǎn)生了紫色化合物(圖1)。我們推測(cè)NaOH同樣具有開裂格爾德霉素的芳香環(huán)與安莎橋之間形成的酰胺鍵作用。楊紅玲等9在除莠霉素A(herbimycin A)結(jié)構(gòu)類似物的分離鑒定中提及用堿處理除莠霉素A及其衍生物可以產(chǎn)生紫色化合物。    格爾德霉素和除莠霉素A均屬于苯安莎類抗生素。通過(guò)堿性處理使苯

11、安莎類抗生素中芳香環(huán)與安莎橋之間形成的酰胺鍵開裂、產(chǎn)生紫色化合物，有可能成為早期鑒別苯安莎類抗生素的一個(gè)特異性顏色反應(yīng)方法。本文表明該顏色反應(yīng)可用于具有產(chǎn)生安莎類抗生    圖1    CH3ONa打開格爾德霉素的芳香環(huán)與安莎橋之間形成的酰胺鍵素潛能的放線菌發(fā)酵液粗提物的分析，并在苯安莎類抗生素(格爾德霉素)的生物合成基因阻斷變株發(fā)酵產(chǎn)物的早期鑒別中，也發(fā)揮了顯著作用。    1  材料與方法    1.1  材料    (1

12、)菌株  Streptomyces hygroscopicus 17997CT1，格爾德霉素生物合成后修飾基因阻斷變株10(原株具有格爾德霉素產(chǎn)生能力)；鏈霉菌Streptomyces sp. 44以及Streptomyces sp. 357為從土壤中分離的2株發(fā)酵產(chǎn)物未知的鏈霉菌(AHBA合酶基因篩選陽(yáng)性菌株)7；這些菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。    (2)試劑  甲醇鈉(sodium methoxide，anhydrous powder)為ACROS ORGANICS公司試劑。NaOH為國(guó)產(chǎn)分析純化學(xué)試劑。格爾德霉素對(duì)照品，本實(shí)驗(yàn)室自備。利

13、福霉素SV標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。硅膠板為青島海洋化工廠分廠GF254產(chǎn)品和德國(guó)Merck公司Silica Gel 60 F254產(chǎn)品。    1.2  方法    取一定量格爾德霉素對(duì)照品或待測(cè)菌株發(fā)酵上清液的乙酸乙酯提取物，溶于無(wú)水甲醇中，點(diǎn)樣于硅膠板上，在乙酸乙酯二氯甲烷正己烷甲醇(9661)溶媒系統(tǒng)中展層。展層結(jié)束后，用少量NaOH(2.0mol/L)溶液進(jìn)行噴涂，觀察TLC平板上的顏色變化，照相記錄。    取一定量格爾德霉素對(duì)照品或待測(cè)菌株發(fā)酵上清液的乙酸乙酯提取物，溶于無(wú)水甲醇中，于玻璃試管或eppendorf管中直接加入約等質(zhì)量的NaOH(濃度為2.0mol/L)或甲醇鈉(固體粉末，或者其甲醇溶