菠蘿蛋白酶的提取純化及化學修飾對其活性的影響

1、菠蘿蛋白酶的提取純化及化學修飾對其活性的影響 實驗研究內(nèi)容：（1） 菠蘿蛋白酶活力測定方法的確定；（2） 菠蘿蛋白酶的穩(wěn)定性研究；（3） 菠蘿蛋白酶的純化；（4） 菠蘿蛋白酶的修飾；（5） 修飾酶與修飾酶的活力比較。參考文獻：提取菠蘿酶工藝的研究胡莉娟，楊凌職業(yè)技術(shù)學院藥物工程系 菠蘿蛋白酶的提取及其在醫(yī)藥中的應(yīng)用李淑喜，黎新明不同金屬離子對菠蘿蛋白酶活性及熱穩(wěn)定性的影響曾霖霖，黃惠華 聚乙二醇對菠蘿蛋白酶的化學修飾吉林大學生命科學學院1、菠蘿蛋白酶的提取純化：單寧沉淀法：原理:菠蘿蛋白酶是典型的巰基蛋白質(zhì), 廣泛存在于菠蘿果實、芽、葉、莖中, 分子量為33 000, 能分解蛋白質(zhì)和酰胺等。它

2、的水解活性較木瓜酶高10 倍以上。因此有廣泛的用途。它作為一種食品添加劑可用于肉質(zhì)嫩化、啤酒澄清. 還用于膠、水解蛋白的生產(chǎn), 在醫(yī)藥上它可在生物體內(nèi)溶解纖維蛋白及血凝塊。因此可以治療水腫及多種炎癥, 它能迅速溶痂。對正常組織無害, 不影響植皮, 適用于中小面積深度燒傷的治療。1.1技術(shù)路線：鮮果皮汁（加5%苯甲酸鈉液，混勻10min）混合液（離心4000rmp，7min）上清液（加入單寧液，邊加邊攪15min）酶糊復(fù)合物（離心4000rmp，5min）沉淀物1.2操作要點:（1）菠蘿蛋白酶的提取稱取1 kg制備好的鮮果皮汁, 加5% 苯甲酸鈉溶液10 ml攪勻, 以4 000 r/ min

3、心7 min, 取上清液倒人干凈燒杯中,每個燒杯中100ml溶液。緩緩加入0.2%單寧溶液10 ml, 邊加邊拌約1 5min, 沉淀物析出, 靜止40 min。虹吸除去上清廢液, 把酶復(fù)合沉淀物倒入離心杯中, 以4 000 r/ min。離心5 min, 倒掉上清廢液, 得到酶糊復(fù)合物。(2)分離、洗滌和保護把提取的蛋白酶糊倒入燒杯中, 加0. 1% EDTA 溶液100 ml 攪勻, 再將1. 5% 氯化鈉溶液200 ml 倒人燒杯中攪勻, 以4 000 r/ min離心7 min, 倒掉上清廢液, 得到洗滌劑酶復(fù)合沉淀物。把洗滌劑酶復(fù)合沉淀物倒入燒杯中, 加0. 5% 乙酸鋅溶液20 m

4、l, 攪拌均勻, 靜止5 min,加0. 06%抗壞血酸溶液30 ml, 攪勻, 靜止5 min,加1. 5% 氯化鈉溶液20 ml, 攪勻, 靜止5 min, 最后再加0. 5% EDTA 溶液20 ml, 攪勻, 靜止5min, 以4 000 r/ min 離心7 min, 把上清廢液倒掉, 得到洗滌劑酶復(fù)合沉淀物。把洗滌劑酶復(fù)合沉淀物倒入燒杯中, 加0. 5% 硫代硫酸鈉溶液20 ml, 攪勻, 靜止5 min;加1% L- 半胱氨酸溶液10 ml, 攪勻, 以4 000 r/min 離心7 min, 倒掉上清廢液, 最后得到蛋白酶糊。冷凍、干燥把提取的酶糊放入冰室中( - 12e )

5、, 低溫冷凍15 20 h, 取出解凍, 離心得酶膏,把酶膏倒人裝有氯化鈣或五氧化二磷的干燥器中干燥6 10 h 得干酶, 研磨成粉狀, 低溫保存。純化離子交換技術(shù)已經(jīng)成為分離提取生物大分子的有效方法。與化學方法相比，它分離條件溫和，不引起分子結(jié)構(gòu)的變化。它用于純化菠蘿蛋白酶的關(guān)鍵問題是選擇合適的交換樹脂及相應(yīng)的交換條件。1 試劑與儀器菠蘿蛋白酶粗品、葡糖醛酸對照品、牛血清白蛋白對照品為生化試劑。離子交換柱(250×10mm)；紫外檢測儀(Hitachi Instruments Inc)；蠕動泵(東方科學儀器廠)；自動部分收集器(上海東風電訊儀器廠)；紅外吸收光譜儀(Perkin E

6、lmer 783)；紫外吸收光譜儀(島津UV-210A)。2 實驗方法2.1 層析分離純化經(jīng)預(yù)處理的強酸型陽離子樹脂和經(jīng)組氨酸修飾后的強堿型陰離子樹脂分別裝入250mm×10mm的離子交換柱和離子交換層析柱，柱的長徑比為201，將 兩柱串聯(lián)。在常溫下依次操作：加樣：用移液管量取菠蘿蛋白酶粗品溶液，從交換柱頂部加入。洗脫：用蠕動泵連續(xù)加入氯化鈉溶液洗脫。部分收集：用自動部分收集器收集部分洗脫流出液。檢測：洗脫流出液連續(xù)通過紫外檢測儀，在選定波長下測定其吸光度A，并 自動繪制洗脫曲線。洗脫流出液經(jīng)沉淀、干燥，得到HA精品。2.2 測試方法葡糖醛酸含量測定：參照Bitter-Muit 的咔

7、唑法測定，與葡糖醛酸對照品對照。 蛋白質(zhì)含量測定：參照Lowry法測定，與牛血清白蛋白對照品對照。黏度及分子量的測定：參照Shimada法，采用烏氏粘度計。參比液為pH7.3的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，測定溫度28±0.05，三點外推至比濃度為0，求出 特性黏數(shù)，并計算出分子量。紅外吸收光譜(KBr 壓片)：分辨率為2.4cm-1，在4000cm-1400cm-1范圍掃 描。紫外吸收光譜：掃描范圍190nm,300nm,掃描速度為100nm/min。2、NEM對菠蘿蛋白酶的修飾：60gNEM溶于40ml干燥吡啶，加入1.01g琥珀酸酐，60度保溫2h，在60度減壓蒸餾除去溶劑。加

8、入苯至殘余物溶解，再加100ml冷己烷，4度振蕩2h。過濾，殘渣溶于蒸餾水后透析，凍干。將其與菠蘿蛋白酶按配比投料，加入0.1mol/L檸檬酸緩沖液（PH 3.0），4度反應(yīng)4h。產(chǎn)物在PH 4.6檸檬酸緩沖液中透析，凍干后得NEM-菠蘿蛋白酶（修飾酶）。3、修飾酶與未修飾酶活性比較：3.1測定原理：菠蘿蛋白酶將酪蛋白分解，生成在三氯乙酸溶液中不沉淀的多肽，并在275 nm處有吸收峰，除去未被消化的酪蛋白，用分光光度計(275 nm)測定溶液中所含肽的數(shù)量。蛋白酶活力單位的定義為：在一定溫度和pH值條件下，l min水解酪蛋白產(chǎn)生l g酪氨酸為l個酶活力單位，以U/g(U/mL)表示。3.2步驟：（1）分別取修飾酶與未修飾酶，溶解于0.05mol/L磷酸緩沖液中（PH 7.0）至10ml，離心得上清液（2）取1