微生物分子生態(tài)學研究方法綜述

1、環(huán)境微生物分子生態(tài)學研究方法綜述摘 要：對當前國內(nèi)外環(huán)境微生物多樣性的分子生態(tài)學研究方法進行了總結(jié)和探討，包括微生物化學成分的分析的方法和分子生物學的方法，以目前比較成熟前沿的分子生物學的方法16S rRNA基因序列分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)/溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和擴增核糖體DNA限制性分析(ARDRA)、末端限制性片段多態(tài)性(T-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)為例。在環(huán)境微生物多樣性研究中，如果可能的話，需要將各種方法結(jié)合起來使用，方可掌握有關環(huán)境生物多樣性的較為全面的信息。更好的揭示環(huán)境變化現(xiàn)狀和預示環(huán)境的變化趨勢，為環(huán)境改善修復提

2、供有利依據(jù)。關鍵詞：環(huán)境微生物；分子生物學；DGGE；ARDRA；T-RFLP1 引言環(huán)境微生物是指環(huán)境中形體微小、結(jié)構(gòu)簡單的生物，包括原核微生物(細菌、藍細菌、放線菌)、真核生物（真菌、藻類、地衣和原生動物等）。數(shù)量龐大、種類繁多的環(huán)境微生物是豐富的生物資源庫1，也是環(huán)境中最活躍的部分，全部參與環(huán)境中生物化學反應，在物質(zhì)轉(zhuǎn)換、能量流動、生物地球化學循環(huán)及環(huán)境污染物的降解和解毒2過程中具有極其重要的作用，亦是評價各種環(huán)境的重要指標之一。比如土壤微生物的數(shù)量分布，不僅可以敏感地反映土壤環(huán)境質(zhì)量的變化，而且也是土壤中生物活性的具體體現(xiàn)3。河道、湖泊中微生物量也可以反映該水體的健康狀況。微生物群落結(jié)

3、構(gòu)和多樣性是環(huán)境微生物生態(tài)學研究的熱點內(nèi)容。微生物群落結(jié)構(gòu)的研究主要通過描述微生物群落的穩(wěn)定性、微生物群落生態(tài)學機理以及自然或人為干擾對群落產(chǎn)生的影響，揭示環(huán)境質(zhì)量與微生物數(shù)量和活性之間的關系4。微生物群落多樣性，是指土壤微生物群落的種類和種間差異，微生物群落多樣性包括物種多樣性、遺傳多樣性及生理功能多樣性等5。物種多樣性是群落中的微生物種群類型和數(shù)量，其中豐度和均度是多樣性指數(shù)中的兩個組成部分，也是多樣性分析中最直觀、最容易理解的要素。研究微生物多樣性的傳統(tǒng)方法是將微生物從環(huán)境中分離、實驗室培養(yǎng)和鑒定6。然而，微生物種類繁多，自然界中僅有極少數(shù)微生物得到鑒定。現(xiàn)代分子生物學方法為全面掌握微生

4、物多樣性提供了可能。2 微生物化學成分的分析的方法根據(jù)細胞生物學相關原理，不同種類微生物細胞的化學組成也不一樣。根據(jù)微生物化學成組成進行微生物多樣性分析是分析微生物群落的方法之一。經(jīng)過發(fā)展研究，主要有：1.1 群落水平生理學指紋方法(CLPP)微生物所含的酶與其豐度或活性密切相關的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質(zhì)，則這種酶-底物可作為此群落的生物標記分子之一。由Garland和Mills7于1991年提出的群落水平生理學指紋方法(CLPP)，是一種通過檢測微生物樣品對底物利用模式來反映種群組成的酶活性的分析方法。具體而言，CLPP就是通過檢測微生物樣品對多種不同的單一碳

5、源的利用能力，來確定哪些基質(zhì)可以作為能源，從而產(chǎn)生對基質(zhì)利用的生理代謝指紋。近年來，國內(nèi)有韓蕙等人8利用BIOLOG YT、FF微孔板分別考察了4個真菌群落代謝活性及群落間的代謝相似性,并與聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）結(jié)構(gòu)相似性分析對比試圖探討代謝相似性與結(jié)構(gòu)相似性的內(nèi)在聯(lián)系,探討了超低溫凍存法作為樣品保存手段對真菌群落特征BIOLOG分析結(jié)果的影響。還有楊永華等9用CLPP方法對農(nóng)藥污染土壤中的微生物群落進行了研究，測定結(jié)果顯示，污染土壤的Shannon指數(shù)和均度、Simpson指數(shù)、Mclntosh指數(shù)和均度都明顯低于無污染的土壤。這表明，農(nóng)藥污染導致了土壤中微生物

6、代謝功能多樣性的下降，同時也導致了微生物種類的減少。1.2 生物標記物法（Biomarkers）生物標記物通常是微生物細胞的生化組成成分，其總量通常與相應生物量呈正相關。特定的Biomarkers標志著特定的微生物，一些生物標記物的組成模式(種類、數(shù)量和相對比例)可作為指紋估價微生物群落結(jié)構(gòu)。生物標記物法（Biomarkers）包括：醌指紋法(Quinones Profiling)；磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）譜圖分析法；目前應用最廣的是PLFA和FAME兩種。以脂肪酸甲酯分

7、析法為例，脂肪酸甲酯分析法就是基于生物標記分子基礎之上，不依賴微生物培養(yǎng)技術，提供微生物種群中脂肪酸組成信息的一種分析法。脂肪酸是細胞中相對穩(wěn)定的組成成分，不同微生物的脂肪酸在組成和含量上有較大差異，它和微生物的遺傳變異、耐藥性等有極為密切的關系。大多數(shù)革蘭氏陽性菌(G+)中支鏈C15:0脂肪酸豐度很高，而在大多數(shù)革蘭氏陰性菌(G-)菌中C16：0豐度較高10。一些細菌如考克斯氏體屬、土拉弗朗西絲菌屬11、假單孢菌屬和結(jié)核分枝桿菌屬細菌12有其特殊的脂類，可經(jīng)磷脂脂肪酸分析實現(xiàn)鑒定，因此脂肪酸圖譜的改變就代表著微生物種群的改變。FAME法已經(jīng)廣泛應用到化學物質(zhì)污染和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動引起的微生物種群

8、組成和結(jié)構(gòu)改變的研究中13。近些年來，磷脂脂肪酸分析方法也逐漸被應用于土壤微生物多樣性的研究中來，并作為土壤微生物種群變化的監(jiān)測指標14。3 以PCR為基礎的分子生物學分析方法用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析的基因組DNA的序列包括：核糖體操縱子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重復序列和隨機基因組序列等。最常用的標記序列是核糖體操縱子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在細胞中相對穩(wěn)定，同時含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類的一個重要指標。16SrDNA廣泛存在于所有原核生物的基因組中。序列變化比較緩慢，與物種的形成速度相適應，而且一般不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。應用分子生物學方法，克服了傳統(tǒng)微

9、生物生態(tài)學研究技術的局限性，能獲取更加豐富的微生物多樣性信息，推動著當今微生物生態(tài)學研究的進一步發(fā)展。下面介紹近年來分子生物學在微生物生態(tài)學研究中較為成熟的技術。如圖1，圖1是分子生物技術在微生物多樣性研究中的應用圖解。圖1 分子生物技術在微生物多樣性研究中的應用圖解2.1 16S rRNA基因序列分析16S rRNA基因序列分析主要是基于已建立的16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)庫，用于確定細菌的系統(tǒng)發(fā)育來判斷物種間進化關系，通過比較16SrRNA基因的序列，可確定新的離菌株在進化上的地位，并使序列探針能夠識別未知菌。目前，16S rRNA基因序列分析已被廣泛應用于微生物多樣性的研究，為微生物的系

10、統(tǒng)發(fā)育和未知菌的鑒定提供了全新的方法，并取得了一些有意義的結(jié)果。1970年Woese利用16S rRNA寡核苷酸序列分析技術，發(fā)現(xiàn)了一類在系統(tǒng)發(fā)育上與其它細菌存有很大差異的微生物-古細菌，奠定了有關古生物、真細菌和真核生物“三域”理論的基礎15,16。戴欣等17通過構(gòu)建16S rRNA基因庫對中國南海南沙海區(qū)沉積物中的細菌多樣性進行了分析,表明在中國南沙海區(qū)沉積物中存在豐富的微生物多樣性,并潛藏著特有的微生物資源。孫磊等18通過對水稻內(nèi)生細菌16S rRNA基因克隆文庫中陽性克隆的序列測定證實引物對799f-1492r完全適用于非培養(yǎng)的分子生物學方法對水稻內(nèi)生細菌的研究，對水稻（Oryza s

11、ativa L.）內(nèi)生細菌和根結(jié)合細菌群落多樣性及群落動態(tài)變化進行了分析。2.2 變性梯度凝膠電泳(DGGE)溫度梯度凝膠電泳 (TGGE)DGGETGGE是兩個相似的研究微生物多樣性的方法。這種技術最初是為了檢測DNA序列中的點突變。Muyzer等191993年開始利用這個技術來研究微生物的遺傳多樣性。主要步驟是：提取土壤樣品中的DNA，利用通用引物PCR擴增16S或18S中的目的片段，在變性劑梯度或者溫度梯度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳。為了保證DNA片段在聚丙烯酰胺凝膠中分離時至少部分DNA保持雙鏈，在正向引物的5 端加上3540個堿基的GC發(fā)卡，否則在梯度凝膠中DNA將完全變性成單鏈。理論上

12、，DGGE可以分開只有一個堿基差別的DNA序列。DGGETGGE方法可以探測到低豐度的種群。段學軍等20。利用DGGE技術評價了重金屬鎘污染對土壤微生物群落影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度鎘脅迫下稻田土壤間的菌種有明顯差異。羅海峰等21用此技術檢測乙草胺對農(nóng)田土壤細菌多樣性影響，結(jié)果顯示，乙草胺在一定程度上改變了土壤細菌的多樣性，特別是對土壤中的Proteobacteria的-Proteobacteria和-Proteobacteria的影響明顯。王曉丹等22以北京翠湖濕地污水塘、表流濕地和潛流濕地為研究對象，在了解水質(zhì)的基礎上，采用PCR-DGGE和16S rDNA文庫技術對樣品細菌多樣性和優(yōu)勢群落

13、結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果表明在水質(zhì)有明顯變化的同時，微生物數(shù)量、細菌多樣性及優(yōu)勢群落都發(fā)生了明顯變化。DGGETGGE可信度高，重復性好，快速，同時可以分析多個樣品，相對較經(jīng)濟。但是DGGETGGE受樣品DNA提取質(zhì)量、PCR結(jié)果的影響較大。另外，不同序列的DNA片段在聚丙烯酰胺凝膠中也可以有相同的移動特性，因此，一個條帶不一定就代表一個種23。在利用DGGETGGE圖譜得到的部分種群指紋信息進行多樣性研究時，還可以對特異性的條帶割膠回收，PCR擴增并測序，或轉(zhuǎn)膜與特異性引物雜交，這樣就可以提供更多有關群落內(nèi)部特定類群的信息。同時，一些研究者已經(jīng)開始用DGGE研究代謝基因，比如甲烷加氧酶24。這將提

14、供土壤微生物的特殊功能(例如污染物降解功能)多樣性的信息。2.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)同DGGETGGE一樣，SSCP技術最初是用來檢測DNA已知或者特異構(gòu)象，或者點突變的。由于二級結(jié)構(gòu)不同，單鏈DNA在聚丙烯酰胺凝膠中泳動速度不同，借此而被分開。當DNA片段大小相同且沒有變性劑存在的情況下，DNA序列決定了泳動的速度。該方法已經(jīng)應用到根際微生物種群組成、厭氧反應器中細菌群落變化等方面的研究中。然而一些單鏈DNA可以形成不止一個穩(wěn)定的構(gòu)象，因此在凝膠中多個條帶可能代表同一種序列。Vacca等25利用PCR-SSCP圖譜分析六個處理生活污水的實驗型人工濕地進出口、植物根區(qū)及基質(zhì)不同深度的微

15、生物群落的多樣性，以判斷濕地中填料類型、植物種植與否對菌群的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的微生物群落的存在與基質(zhì)類型有關。謝冰等26利用PCR-SSCP技術對上海夢清園蘆葦人工濕地進出口微生物的多樣性， 得出異養(yǎng)菌、硝化細菌和反硝化細菌各個季節(jié)的分布不一，微生物功能群的分布與濕地中不同營養(yǎng)水平有關。2.4 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)和擴增核糖體DNA限制性分析(ARDRA)RFLP、ARDRA是一種基于DNA多態(tài)性的研究微生物多樣性的方法。在Liu等27的研究中，PCR擴增的rDNA被四堿基的限制性內(nèi)切酶酶切，利用瓊脂糖或者非變性聚丙稀酰胺凝膠分離不同長度的片段。但是有時候在不同的種群中，條帶太復

16、雜而無法利用RFLP來分析，因為1個種就可能有6個限制性片段。如果用六個堿基的酶來酶切DNA，每個種的限制性片段就會減少，從而增加了這種方法的可操作性。郭逍宇，董志，宮輝力等人28為探討再生水替代自來水進行草坪灌溉的可行性，對根際層LB培養(yǎng)基10-4稀釋度平板上分離的細菌單菌落提取基因組DNA,擴增16S rDNA片段并用限制性內(nèi)切酶Hinf對PCR產(chǎn)物進行擴增rDNA限制性分析(ARDRA)，并采用綜合多樣性指數(shù)(H)，豐富度指數(shù)(R2)和均勻性指數(shù)(E1)等指標評價再生水灌溉對根際微生物多樣性的影響。夏月等29通過對未污染土壤細菌16S rDNA的克隆,獲得了經(jīng)內(nèi)切酶Hae消化的不同16S

17、 rDNA的ARDRA類型，并對測序的19個克隆子建立了系統(tǒng)發(fā)育樹。此外，還對不同Cd和Pb污染水平的土壤微生物進行了群落水平上的ARDRA分析.結(jié)果表明，5mg.kg-1Cd和500mg.kg-1Pb污染對微生物群落組成有一定影響，但此范圍內(nèi)的重金屬含量微生物群落多樣性沒有相關性影響。Ibekwe等30在變化植物密度和組成的濕地中研究微生物群落的組成與水質(zhì)之間的關系，六個月中每星期對濕地的不同位點的水化學指標、硝酸鹽、正磷酸鹽、懸浮固體進行檢測。發(fā)現(xiàn)50%的植物覆蓋率能將96.3%的硝酸鹽去除。2.5 末端限制性片段多態(tài)性(T-RFLP) 此法與RFLP原理相同，只是在PCR引物的一端用熒光

18、染料進行標記，比如TET(4，7，2，7-四氯-6羧基熒光素)或者FAM(亞磷酰胺-5-羧酸熒光素)。只需檢測被標記的末端限制性片段，就可以分析復雜群落。它提供了關于多樣性的信息，卻簡化了條帶圖譜。條帶組成還可以被用來量度不同樣品中種的豐富度、平均度和相似性。此外，該法可以自動化，對大量土樣進行分析。引物均是根據(jù)現(xiàn)有的16S，18S rRNA和ITS數(shù)據(jù)庫里的信息設計。到目前為止，這些引物只代表了可培養(yǎng)微生物類群，并沒有代表實際樣品中真正的微生物多樣性。另外，應用不同的內(nèi)切酶將產(chǎn)生不同的種群基因指紋，因此有必要利用至少2-4種不同的限制性酶進行T-RFLP分析。許多研究者認為，一旦T-RFLP

19、方法標準化，此法是研究環(huán)境微生物多樣性的有用工具31。Nicorarat等32利用T-RFLP技術對處理酸化煤礦水的人工濕地系統(tǒng)中微生物的多樣性進行分析。將RFLP的結(jié)果與先前的有機體培養(yǎng)PCR、DGGE和FISH研究結(jié)合起來，說明了相對低的微生物多樣性及嗜溫硫桿菌在好氧濕地基質(zhì)中具有優(yōu)勢。Ishida等33通過T-RFLP方法測定不同的水力負荷及水位波動對濕地底泥中微生物結(jié)構(gòu)的影響，并根據(jù)營養(yǎng)物的去除情況確定濕地的性能。Searcy等34利用PCR擴增每個生物菌膜樣本上真核細菌的16S rDNA及亞硝酸還原酶基因，用T-RFLP技術分析擴增產(chǎn)物判斷整個菌群及反硝化細菌群落的多樣性。Sleyt

20、r等35利用T-RFLP技術分析比較蘆葦濕地和芒竹濕地植物根區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同的濕地在相似的條件下運行具有相似的菌群結(jié)構(gòu)。在國內(nèi)相關研究也有很多。林煒鐵等36利用T-RFLP(末端限制性片段長度多態(tài)性)技術，分析硝化細菌富集反應器中的微生物群落結(jié)構(gòu)，并對硝化細菌的豐度進行半定量研究。結(jié)果表明，培養(yǎng)48h后，硝化細菌富集效果最佳，多樣性指數(shù)與初始培養(yǎng)相比下降了62.80，富集出的硝化細菌主要為亞硝酸鹽氧化菌(Nitrobacter)。依此對蝦養(yǎng)殖業(yè)提供了可靠的科學依據(jù)。T-RFLP技術與生物信息學技術結(jié)合，能夠?qū)Νh(huán)境中的微生物多樣性進行實時動態(tài)的檢測，是一種比較靈敏的微生物生態(tài)學研究方

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