重組狗凝血因子Ⅷ的慢病毒介導體外表達的研究

1、重組狗凝血因子的慢病毒介導體外表達的研究         08-03-03 13:15:00     編輯：studa20      作者：孫海英，程海，李振宇，杜冰，曾令宇，鹿群先，何徐彭，潘秀英，徐開林【摘要】  本研究的目的是制備攜帶狗凝血因子（cF）基因的慢病毒載體，探討慢病毒載體能否介導cF在體外的有效表達。用構建攜帶cF基因的慢病毒載體pTK161（含PUB啟動子）和pTK162（含2OH1啟動子），同時

2、構建含綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒載體pTK161（含PUB啟動子）和pTK162（含2OH1啟動子）的方法，分別與包裝質粒NRF、包膜蛋白質粒VSVG共轉染293T包裝細胞，將包裝好的病毒顆粒再感染293T細胞，檢測病毒滴度和培養(yǎng)細胞上清中cF活性。結果顯示：經限制性酶切鑒定，成功構建了pTK161、pTK162、pTK161和pTK162正向連接載體；pTK161和pTK162的病毒滴度分別為1.54×106 U/ml和2.83×106 U/ml；pTK161、pTK162感染靶細胞后24小時細胞上清中即可檢測到cF的表達，72小時表達量達高峰。pTK162載體cF表

3、達活性接近正常狗血漿F活性，而且明顯高于pTK161(p<0.05)，6周后cF表達活性仍達最高值的1/4。結論：構建的自身失活慢病毒載體可攜帶較大片段的cF基因，并在體外可獲得有效表達；本研究為慢病毒載體介導的血友病A的基因治療研究提供實驗依據。 【關鍵詞】  慢病毒     Expression of Recombinated Canine Factor In Vitro Mediated by  Lentiviral Vector      Abstract &#

4、160;  The study was purposed to prepare the recombinant lentiviral vector pTK161 and pTK162 carrying Bdomaindeleted canine factor (BDDcF) gene, and to investigate whether the canine F(c) can be expressed in vitro. The BDDcF gene was ligated behind PUB and 2OH1 promotors to create lentiviral vec

5、tors  pTK161 and pTK162. Meantime lentiviral vectors pTK161 and pTK162 were  produced  by cloning a green fluorescent protein (GFP) into pTK151 and pTK152, which was driven by PUB and 2OH1 promotors respectively. Vector supernatant were prepared by using transfer calcium phosphate med

6、iatedcotransfection of 293T cells. The virus vector, NRF packagingplasmid, and VSVG envelopeplasmid was assayed by titers and cF activity in cell culture supernatant after infection into  293T cells. pTK161, pTK162, pTK161 and pTK162were identified by restriction enzyme analyzing. The results s

7、howed that the lentiviral vectors pTK161,pTK162, pTK161 and pTK162 were successfully constructed, and  the titers of pTK161and pTK162 reached to 1.54×106 U/ml and 2.83×106 U/ml; the activity of cF could be detected at 24 hours after  infection of 293T cells  by pTK161 

8、and pTK162, and achieved the highest level at 72 hours later. The higher level of cF activity was achieved by transfected with pTK162 than that of  pTK161 (p<0.05), which  closed to the cF activity in normal dog plasma. 1/4 of the highest level could be detected 6 weeks later.  It

9、is concluded that  the prepared HIV1based lentiviral vectors can  infect 293T cells to express cF effectively. The results provide the basis for further studying  HIV1based lentiviral vector gene therapy for hemophilia A.    Key words     lentiviral

10、vector；canine factor ；hemophilia A；gene therapy       血友病A是凝血因子（F）基因缺陷導致凝血因子缺乏的X隱性連鎖的出血性疾病。目前該病的治療方法主要是輸注血漿源性F制品或基因重組F產品，這種蛋白替代療法療效肯定，但存在費用昂貴、血源性病毒感染、反復輸注會產生抑制性抗體等許多棘手的問題1-3。由于血友病A是一種單基因遺傳病，基因治療可望成為一種有效治療手段4。 本研究分別構建了含有 PUB 啟動子和2OH1啟動子cF的慢病毒表達載體pTK161和pTK162，采用三質粒包裝系統(tǒng)，檢

11、測感染細胞上清中的cF活性，為血友病A慢病毒載體介導基因治療尋求有價值的實驗依據。     主要試劑    各種工具酶、1 kb DNA Ladder、質粒小量提取試劑盒WizardTM Plus SV Minipreps DNA Purification Systerm、目的基因純化試劑盒WizardTM PCR DNA Purification System、線性化載體純化試劑盒WizardTM DNA CleanUp System均購自Promega 公司，凝血因子F活性檢測試劑盒CoamaticR 

12、0; Factor 購自Chromogenix公司。    質粒、菌種、包裝細胞    慢病毒載體pTK151（含有PUB啟動子）、慢病毒載體pTK152（含有2OH1啟動子）由本室構建，pBKCMV（含B區(qū)缺失型FcDNA，BDDFcDNA）由北卡大學基因治療中心晁恒軍博士惠贈，包裝質粒NRF、包膜質粒VSVG、感受態(tài)大腸桿菌、包裝細胞293T等均由本室制備或保存。    載體的構建及鑒定    用Xba I和EcoR V雙酶切pBKCMV，得到4 400 bp的BDDFc

13、DNA片段,用低熔點凝膠進行電泳，WizardTM PCR DNA Purification System 純化后作為插入片段。用Xba I和Hpa I雙酶切pTK151，與純化后的BDDFcDNA片段進行連接反應，連接后的載體用BamH酶切鑒定，將正確的載體命名為pTK161。用Afe I單酶切pTK152，CIAP去5P，WizardTM DNA CleanUp System純化后，將插入片段BDDFcDNA插入到pTK152的Afe I酶切位點上，連接后載體用BamH鑒定，將正確的載體命名為pTK162（圖 1）。    Figure 1. 

14、60; Construction  map  of  Lentiviral  vector  including  BDDFcDNA.  重組慢病毒的包裝    采用磷酸鈣共沉淀法5將重組質粒pTK161、pTK162（各15 g）分別與包裝質粒NRF（10     g）、包膜蛋白質粒VSVG（5 g）共轉染293T細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)過夜，12小時后更換 無血清培養(yǎng)液，于37、5% CO2條件下 繼續(xù)培養(yǎng)。60小時后收集病毒上清，過濾后

15、-80保存。此外，在pTK151的PUB后插入綠色熒光蛋白（GFP）基因（pTK161）和在pTK152的2OH1后插入GFP后（pTK162），觀察GFP表達情況。    病毒滴度的測定    將293T細胞按照2×105/孔接種于6孔板上，吸附6小時后，將所收集的含pTK161和pTK162病毒上清分別按對數(shù)級稀釋，將1 ml稀釋后的病毒上清分別加入到相應的孔中，過夜培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)液，48小時后，于熒光顯微鏡下計數(shù)熒光陽性細胞個數(shù)，用下面的公式計算病毒滴度，并用流式細胞儀（FACS）檢測GFP陽性細胞百分率。 

16、;   病毒滴度（U/ml）=GFP陽性細胞數(shù)×    相應的稀釋倍數(shù)6    狗的凝血因子F活性測定    用pTK161和pTK162感染293T細胞后在不同時間點收集細胞上清，按照CoamaticR  Factor 試劑盒操作說明，用發(fā)色底物法檢測細胞上清中cF的活性，以感染前的細胞上清作為空白對照，并以正常狗的混合血漿作為參比血漿，繪制標準曲線（選擇0-1.5 U/ml范圍），將測得的分光光度值在標準曲線上讀數(shù)。    結    果