植物同工酶凝膠電泳實驗

1、植物同工酶凝膠電泳實驗 一、實驗?zāi)康暮鸵饬x同功酶專指受遺傳體系決定的酶的不同分子形式。從作用上看，分子形式不同的酶能做一樣的工作，即催化同樣的生化反應(yīng)，所以把同功酶改稱為同工酶。由于蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)歸根結(jié)底是由基因的DNA分子結(jié)構(gòu)決定的，因此，同工酶就成為鑒定生物基因型是否有差別的可靠指標，在遺傳育種，生長發(fā)育，物種起源，生理衛(wèi)生等領(lǐng)域的研究中成為一種重要的工具；此外，同工酶還與植物抗性有一定聯(lián)系，可用來鑒定抗性的強弱。本實驗的實驗?zāi)康闹饕亲寣W(xué)生掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳分析植物同工酶的原理及方法、步驟。提高學(xué)生的實際操作及動手能力。培養(yǎng)學(xué)生對實驗結(jié)果的分析能力。二、實驗原理帶電粒子在

2、電場中向帶有相反電荷的電極移動，叫做電泳。在一定的pH條件下，每一種分子都具有一定的電荷、大小與形狀，在相同的電場經(jīng)一定時間的電泳，便會集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。不同組分的蛋白質(zhì)（包括同工酶）分子組成、結(jié)構(gòu)、大小、形狀均有所不同，在溶液中所帶的電荷多寡不同，在電場中的運動速度也不同。因此經(jīng)過電泳便會分成不同的區(qū)帶。然后用適當?shù)娜玖现?，這樣就可以在凝膠上展現(xiàn)出蛋白質(zhì)或同工酶的譜帶。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作支持介質(zhì)的一種電泳方法。它是由丙烯酰胺單體（Acr）和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑的作用下，聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。當Acr和Bis遇到

3、自由基時，便能聚合。Acr和Bis的濃度、交聯(lián)度可以決定凝膠的密度、粘度、彈性、機械強度以及孔徑大小。三、材料新舊小麥種子、錦帶花上下枝葉片四、實驗器材與試劑1.器材：電泳儀一套（穩(wěn)壓電源，垂直電泳槽和凹槽玻璃）；臺式高速離心機；燒杯；微量進樣器；注射器；皮頭滴管；刻度吸；培養(yǎng)皿（染色用）。2.試劑：丙烯酰胺（Arc）；甲叉丙烯酰胺（Bis）；四甲基乙二胺（TEMED）；過硫酸銨（AP）；三羥甲基氨基甲烷（Tris）；甘氨酸（Gly）；瓊脂粉；溴酚藍； 甘油；聯(lián)苯胺；醋酸；-醋酸萘酯；-醋酸萘酯；牢藍RR鹽；冰醋酸。3.試劑的配制：見表1五、實驗步驟1樣品的提取 稱取1g不同處理的材料，加入少

4、量提樣緩沖液，置冰浴研磨成勻漿后定容至5ml，8000rpm離心6min，取上清液貯于冰箱備用。2凝膠制備： （1）取電泳玻板，用去污劑洗凈，蒸餾水沖洗，直立干燥。洗凈的玻板內(nèi)面要避免手指觸摸以防沾污。將玻板安裝到電泳槽上。用電極緩沖液配制1.5%瓊脂膠，沸水浴加熱至瓊脂完全溶化后，用皮頭滴管沿板上部灌入兩側(cè)的封膠空隙，注意不要產(chǎn)生氣泡。20分鐘后凝固。（2）按照表1中的A液：B液：水：C液=1：2：1：4的比例配置凝膠，混勻后用一細玻棒引流，緩緩注入膠室中，注膠過程防止氣泡產(chǎn)生。膠液加到與凹槽相平時停止，插入預(yù)先選擇好的樣品梳，注意不要帶入氣泡。（本實驗為A液：B液：水：C液=2.5：5：2

5、.5：10）3.點樣及電泳：（1）向上下槽注入電極緩沖液，取下樣品梳（不要拉斷樣槽隔墻）。將少許提取液與溴酚藍指示劑以5：1混合。用微量進樣器針頭插入樣槽下部慢慢進樣。每槽點樣30l。 （2）上槽接負極，下槽接正級，接通電源，電流調(diào)至1520mA，電壓為200V，電泳至溴酚藍標志到達凝膠前沿1 cm處，將電流、電壓調(diào)至零后斷電。（3）電泳結(jié)束后，取下玻板，將兩塊玻板置自來水龍頭下，借助水流，用解剖刀柄輕輕從板側(cè)縫間撬開玻板（注意切忌從凹槽處撬），將膠放入染色液中。4.染色：（1）過氧化物酶染色 聯(lián)苯胺貯存液16ml（2g聯(lián)苯胺溶于18ml文火加熱的冰醋酸中，再加水72ml），0.6%過氧化氫1

6、6ml，水48ml。將膠板浸入此液中，待出現(xiàn)蘭色條帶后，棄去染色液用水洗滌保存。（2）酯酶同工酶顯色 稱取30mg -醋酸萘酯，30mg-醋酸萘酯，50mg堅牢藍RR（或堅牢藍B），先用約4ml丙酮溶解，再用0.1mol/L pH6.5的磷酸緩沖液稀釋到60ml，將膠板浸入此液中，室溫下顯色約20min，可看到桃紅色的磷酸酯酶同工酶區(qū)帶。棄去染色液，用蒸餾水漂洗。5.結(jié)果保存： 將脫過色的凝膠按照顏色深淺繪成的譜帶圖作為實驗報告的憑證。表1 試劑配方溶液配方pH濃度A液1mol/L鹽酸 48mlTris 36g四甲基乙二胺（TEMED） 0.24ml蒸餾水定容至100ml8.97.5%B液丙烯酰胺（Arc） 30g甲叉丙烯酰胺（Bis） 0.8g蒸餾水定容至100mlC液過硫酸銨（AP） 1g蒸餾水定容至100ml電極緩沖母液Tris 6g甘氨酸（Gly） 28.8g蒸餾水定容至1000ml（使用時稀釋10倍）8.3提樣緩沖液：電極緩沖液樣品處理液：溴酚藍0.1g； 甘油40ml；水60ml六實驗結(jié)果與分析過氧化物酶 酯酶 從左到右依次是新種子、舊