簡便快速獲取人膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子基因的PCR方法

1、    簡便快速獲取人膠質(zhì)細胞源神 經(jīng)營養(yǎng)因子基因的PCR方法        【摘要】目的：建立簡便快速地獲取人膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）基因的PCR方法。方法：根據(jù)從GeneBank中調(diào)出的人GDNF基因全序列設計引物，提取人基因組DNA做模板行PCR， 經(jīng)酶切和凝膠電泳鑒定產(chǎn)物。結(jié)果：擴增出425bp的人GDNF基因，經(jīng)EcoR I酶切可見預期的341bp片段，證實獲得正確的產(chǎn)物。結(jié)論：成功建立了一種簡便快速地從人基因組DNA獲取人GDNF基因的PCR方

2、法，避免了其他作者為獲得GDNF基因而采取收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤標本，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR等較為繁瑣的步驟，省時省力，經(jīng)濟實用?！娟P(guān)鍵詞】人膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子 基因組DNAPCR 1993年Lin1等從膠質(zhì)細胞中分離出一類新型神經(jīng)營養(yǎng)因子，能顯著促進黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)存活，故稱膠質(zhì)細胞源神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line derived-neurotrophic factor,GDNF）。迄今研究表明GDNF對多巴胺能神經(jīng)元、去甲腎上腺素能神經(jīng)元、運動神經(jīng)元和前腦膽堿能神經(jīng)元等都有營養(yǎng)作用，GDNF在神經(jīng)變性疾病的動物模型中所取得的效果表明它可望用于治療一系列神經(jīng)變性疾病，如帕金森病、

3、與膽堿能神經(jīng)元衰退相關(guān)的癡呆癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥及其它運動神經(jīng)元變性疾病等2，3。最近還發(fā)現(xiàn)GDNF能防止腦缺血后的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡4，提示它也可望用于治療腦卒中。因此，我們建立簡便快速地擴增人GDNF基因的PCR方法，為人GDNF因基的克隆和表達及臨床應用打下基礎(chǔ)。1材料與方法1材料GDNF上游引物：5CGGGATCCATGTCACCAGATAAACAAATG3 BamH I下游引物：5CGGGATCCTCAGATACATCCACACCT3 BamH I由TaKaRa公司合成。Taq DNA polymerase購自TaKaRa公司，EcoR1和Marker /EcoR I-Hind III

4、購自華美公司。2方法2.1提取人基因組DNA：收集人外周血白細胞，加入2ml TE(20mM Tris pH8.0, lmM EDTA)懸浮細胞，再加入0.5% SDS，100mg/L蛋白酶K，37水浴消化2小時，加入等體積酚氯仿抽提，取上相加入2倍體積無水乙醇沉淀，70%乙醇洗，空氣干燥后溶于無菌水中，即獲得人基因組DNA。2.2PCR擴增：50l反應體系中10x buffer(含Mg2+)5l，2.5mM dNTPs 4l，5M上下游引物各2.5l，人基因組DNA100ng,Taq DNA polymerase U。循環(huán)條件為941分鐘，541分鐘，721分鐘，擴增30次。2.3擴增產(chǎn)物的

5、鑒定：取8l擴增產(chǎn)物，加入1l10x buffer, 1l EcoR I(14U/l)，37水浴消化2小時。取消化的擴增產(chǎn)物及未消化的擴增產(chǎn)物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以 /EcoR I-Hind III為分子量標準。2結(jié)果1PCR擴增人GDNF基因注：1:/EcoR I-Hind III Marker,2:擴增的人GDNF基因片段，3: EcoR I酶切人GDNF基因片段，4：PCR陰性對照由1可見，人基因組DNA經(jīng)我們建立的PCR方法擴增后，得到425bp大小片段，該片段經(jīng)EcoR I消化后可見341bp的片段，與實驗設計相吻合。3討論自GDNF被發(fā)現(xiàn)以來，此項研究領(lǐng)域非?；钴S。目前國內(nèi)已

6、有幾家在開展這方面的工作，他們均是收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤標本，提取其RNA后行逆轉(zhuǎn)錄PCR而得到GDNF基因5、6。我們通過分析得知人GDNF基因并不含有內(nèi)含子，因而認為以人基因組DNA為模板即可通過PCR獲取編碼完整GDNF蛋白的基因，實驗結(jié)果顯示我們獲得400bp大小的片段，與其他作者報道：用逆轉(zhuǎn)錄PCR得到的GDNF基因大小一致，從而證實了我們設計的正確性。在引物的設計方面，我們從GgneBank 中調(diào)出人GDNF基因的全序列485bp，其中81-482bp編碼成熟的GDNF蛋白，152bp有單一的EcoR I酶切位點。Lin等的研究結(jié)果顯示編碼成熟的GDNF蛋白的這段片段可在原核系統(tǒng)中表達，且

7、有生物學活性1。因此，我們針對81-428 bp片段設計引物，上游引物為81-98bp，前面加上ATG這一翻譯起始密碼，下游引物為468-482bp，后面加上TGA這一翻譯終止密碼，引物5端加上BamH I識別序列及修飾堿基，以利于下一步的克隆。總之，我們成功建立了一種簡便快速地擴增人GDNF基因的PCR方法，免除了收集神經(jīng)膠質(zhì)瘤標本，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄等較為繁瑣的步驟，省時省力，經(jīng)濟實用，為我們下一步研究工作的開展提供了有利條件。張玲（430060武漢，湖北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）王穎群（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心）吳佐泉（廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院醫(yī)學實驗中心）余紹祖（430060武漢，

8、湖北醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科）參 考 文 獻1，Lin LF,Doherty DH,Lile JD,et al. GDNF,a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.Science, 1993,260:11302，Gash DM, Zhang Z, Ovadia A, et al. Functional recovery in Parkinsonian monkeys treated with GDNF. Nature, 1996,380:2523，Gash DM. Neuroprotective and neurorestorative properties of GDNF.Ann Neurol science, 1998,44(3 Suppl 1):S1214，Miyazaki H, Okuma Y, Fujii Y, et al. Glial cell line-derive