褪黑素對(duì)花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化的影響及機(jī)制(

1、    褪黑素對(duì)花萼海綿誘癌素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化的影響及機(jī)制(1)    目的 探討褪黑素(Mel)對(duì)花萼海綿誘癌素(CA)在成神經(jīng)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化中的影響及其機(jī)制。方法 采用鼠野生型成神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2awt)，給予CA處理，或同時(shí)給予不同濃度Mel或維生素E(Vit E)處理，并用免疫印跡法檢測神經(jīng)細(xì)絲磷酸化水平和蛋白磷酸酯酶2A(PP2A)含量，32P特異底物標(biāo)記技術(shù)檢測PP2A活性。結(jié)果 CA可在N2awt細(xì)胞引起神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化，同時(shí)伴有PP2A含量和活性降低。Mel對(duì)CA引起的神經(jīng)細(xì)

2、絲過度磷酸化有保護(hù)作用，且強(qiáng)于Vit E；Mel同時(shí)對(duì)抗CA誘導(dǎo)的PP2A活性和含量降低。結(jié)論 Mel可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)PP2A的含量和活性而減輕CA引起的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化。關(guān)鍵詞：阿爾茨海默?。换ㄝ嗪＞d誘癌素；褪黑素；神經(jīng)細(xì)絲；過度磷酸化ABSTRACT: Objective To investigate the in vivo effect of melatonin on calyculin Ainduced neurofilament (NF) hyperphosphorylation in neuroblastma cells (N2awt). Methods N2awt cells

3、were treated with CA or CA and different concentration melatonin or CA and vitamin E, the levels of neurofilament phosphorylation and the level of PP2A were detected, and the activities of PP2A were assayed. Results Calyculin A treatment led to neurofilament hyperphosphorylation

4、by decreasing the level and activity of PP2A. Both melatonin and vitamin E had protective effect on calyculin Ainduced neurofilament hyperphosphorylation, although melatonin increased the activity of PP2A while vitamin E did not. Morever, melatonin partially attenuated the decreasing of PP2A level.

5、Conclusion Melatonin protects neuroblastma cells from CAinduced neurofilament hyperphosphorylation through the regulation of PP2A level and the increase of PP2A activity.KEY WORDS: Alzheimers disease; calyculin A; melatonin; neurofilament; hyperphosphorylation阿爾茨海默病(Alzheimers disease, AD)是一種以進(jìn)行性記憶減

6、退和認(rèn)知功能障礙為主臨床癥狀的神經(jīng)退行性疾病，神經(jīng)原纖維纏結(jié) (neurofibrillary tangles, NFTs) 是其主病理特征之一。NFTs主由異常過度磷酸化的tau蛋白構(gòu)成，tau蛋白作為細(xì)胞內(nèi)的主骨架蛋白，對(duì)微管組裝、維持微管穩(wěn)定性都具有重作用。神經(jīng)細(xì)絲(neurofilament，NF)是骨架蛋白中的中間絲，由低(NFL)、中(NFM)、高(NFH)分子量的三種亞基組成，它與微管、微管相關(guān)蛋白(包括tau蛋白在內(nèi))等其他骨架蛋白存在廣泛的相互作用，并共同維持著細(xì)胞骨架的正常結(jié)構(gòu)。Nancy 等證實(shí)異常過度磷酸化的神經(jīng)細(xì)絲也是NFTs的重組成成分，因此其在AD發(fā)病機(jī)制中的作用

7、也日益受到重視。褪黑素(melatonin，Mel)是由松果體分泌的一種具有多種生物學(xué)功能的內(nèi)分泌激素，隨著年齡的增長其分泌量逐漸下降。研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦脊液中Mel的水平顯著低于同年齡正常人群，臨床上AD患者給予Mel后，可以改善某些患者的認(rèn)知功能。因此，Mel分泌紊亂在AD的發(fā)病過程中可能起重作用。最近有人報(bào)道，Mel可阻斷或逆轉(zhuǎn)岡田酸(okadaic acid, OA)在神經(jīng)瘤細(xì)胞(N1E115)引起的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和微管破壞。我們?cè)鴪?bào)道Mel可對(duì)抗花萼海綿誘癌素(calyculin A, CA)在SY5Y細(xì)胞引起的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化。為進(jìn)一步研究Mel對(duì)抗CA引起的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸

8、化的機(jī)制，我們分別用Mel和維生素E(vitamin E, Vit E)與CA同時(shí)處理成神經(jīng)瘤細(xì)胞N2awt，用免疫印跡法檢測神經(jīng)細(xì)絲磷酸化水平和PP2A含量，免疫標(biāo)記技術(shù)檢測PP2A活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Mel和Vit E可對(duì)抗CA引起的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化，同時(shí)Mel對(duì)抗CA引起的PP2A活性降低和含量降低。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了Mel和Vit E對(duì)抗CA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的機(jī)制。1 材料與方法1.1 主試劑 DMEM、OptiMEM、胎牛血清(FBS)購自美國Gibico公司；丙烯酰胺(Arc)、N，N亞甲叉雙丙烯酰胺(Bis)、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、甘氨酸(Glyc

9、ine)、小牛血清白蛋白(BSA)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、Mel、Vit E均為美國Sigma公司產(chǎn)品；過硫酸銨(AP)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒購自美國Pierce公司；硝酸纖維素膜(NC膜)為 Hybond公司產(chǎn)品；單克隆抗體SMI31(識(shí)別磷酸化的NFH、NFM，15000)、SMI32(識(shí)別非磷酸化的NFH、NFM，15000)、R123d(識(shí)別PP2A的催化亞單位，11500)購自Sternberger公司，所用抗體稀釋液為50g/L脫脂奶粉，TBS/T配制；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗和ECL顯色系統(tǒng)購自Santa Cruz公司；CA購自美國Biochemical公司

10、；32PATP購自北京亞輝生物醫(yī)藥公司。1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 鼠野生型成神經(jīng)瘤細(xì)胞貼壁生長細(xì)胞株(N2awt)由許華熙教授(The Burnham Institute, La Jolla, California, USA)提供，細(xì)胞用含50g/L胎牛血清(FBS)的DMEM/OptiMEM(11)培養(yǎng)基，在5%(體積分?jǐn)?shù))CO2、37培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，每2-3d更換培養(yǎng)液一次，細(xì)胞達(dá)約70%-80%豐度時(shí)，傳代或用于實(shí)驗(yàn)。給藥處理前，細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12h誘導(dǎo)分化。細(xì)胞分為6組：正常對(duì)照組，加入含DMSO(<0.01%體積分?jǐn)?shù))的培養(yǎng)基；CA組，加入5nmol/L CA；25mol/L

11、 Mel組，加入5nmol/L CA同時(shí)加入25mol/L Mel；50mol/L Mel組，加入5nmol/L CA同時(shí)加入50mol/L Mel；100mol/L Mel組，加入5nmol/L CA同時(shí)加入100mol/L Mel；Vit E組，加入5nmol/L CA同時(shí)加入50mol/L Vit E。1.3 蛋白質(zhì)印跡分析 按上述分組加藥處理細(xì)胞12h后，棄培養(yǎng)基，預(yù)冷的PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液90L(50mmol/L TrisCl pH8.0，150mmol/L NaCl, 10mL/L Triton，1g/L SDS，0.2g/L NaN3，100mg/L PMSF，1mg/L

12、 aprotinin，PMSF和aprotinin臨用前加入)，在冰上靜置10min，用細(xì)胞刮刮起細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到EP管中，加入4×加樣緩沖液30L，煮沸10min，超聲破碎(3×5s)，12000g離心10min，取上清。取樣品加入各個(gè)泳道(保證各泳道加入的樣品蛋白總量為10g)，蛋白質(zhì)經(jīng)7.5% SDSPAGE凝膠電泳分離后被轉(zhuǎn)移至NC膜上；NC膜用50g/L脫脂牛奶室溫封閉1h，分別加入單克隆抗體SMI31、SMI32，R123d，4孵育過夜，然后用含1g/LTween20的 TBS(TTBS)漂洗(3×5min)；再加入適當(dāng)稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，37

13、孵育1h，TTBS漂洗(3×5min)；加入ECL顯色液，顯色1min，終止顯色并將膠片置于NC膜上，在暗室里曝光30s，免疫印跡結(jié)果掃描后用圖象分析系統(tǒng)分析。            【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默病摘目的探討褪黑素(Mel)對(duì)花萼海綿誘癌素(CA)在成神經(jīng)瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸         本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)

14、屬原作者，請(qǐng)不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請(qǐng)聯(lián)系我們。1.4 PP2A活性測定 按照Gong等的方法。在磷酸化緩沖液(單位：mmol/L，TrisHCl 40、pH 8.5, ME 20，CaCl2 0.2，MgCl215)中，磷酸化酶b(Phb，2g/L)和0.5mmol/L 32PATP 及10mg/L磷酸化酶激酶(PhK)，在30孵育10min后，Phb被磷酸化為Pha并有一部分被32P標(biāo)記；32P標(biāo)記的磷酸化酶a(32PPha)經(jīng)Sephadex G50柱與游離ATP(Free32P)分離，收集組分中32P Pha的放射性/(Free

15、32P的放射性 32P Pha的放射性)×100%>95%作為PP2A的底物。PP2A 催化32PPha釋放出32P，根據(jù)32P的釋放量可判定PP2A的活性。反應(yīng)體系總體積20L， 含Tris 50mmol/L、pH 7.0，BME 10mmol/L，EDTA 0.1mmol/L，caffeine 7.5mmol/L，7.5mg/L 32PPha和0.06g/L細(xì)胞提取物及0.2g/L抑制因子1(PP1的特異性抑制劑)，反應(yīng)以加入32P Pha開始，30進(jìn)行30min，加入10L終止液(4mmol/L ATP、200g/L 三氯乙酸溶解)終止反應(yīng)，取7L反應(yīng)混合物點(diǎn)到層析紙上，

16、釋放出的32P在50g/L三氯乙酸(0.2mol/L NaCl溶解)層析液中通過上行色譜法與底物分離。然后用Cerenkov 液閃儀進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)分析。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)分析軟件行方差分析，以P<0.05為差異有顯著性。    2 結(jié)    果2.1 Mel和Vit E對(duì)CA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的影響 本研究用識(shí)別磷酸化的神經(jīng)細(xì)絲(NFH，NFM)的抗體SMI31和識(shí)別非磷酸化的神經(jīng)細(xì)絲(NFH，NFM)的抗體檢測神經(jīng)細(xì)絲的磷酸化狀態(tài)。神經(jīng)細(xì)絲的免疫印跡

17、結(jié)果顯示：CA處理后SMI31顯色顯著增強(qiáng)(圖1A)，而SMI32顯色顯著減弱(圖1B)；25、50、100mol/L Mel和Vit E使SMI31顯色減弱(圖1A)，SMI32顯色增強(qiáng)(圖1B)。圖象分析結(jié)果進(jìn)一步顯示：Mel在50mol/L時(shí)對(duì)神經(jīng)細(xì)絲的磷酸化的保護(hù)作用最強(qiáng)，且比同濃度的Vit E的作用更強(qiáng)。結(jié)果提示CA處理12h后N2awt細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)絲發(fā)生了磷酸化，Mel和Vit E對(duì)CA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲的磷酸化有保護(hù)作用。圖1 Mel和Vit E對(duì)CA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲磷酸化的影響（略）2.2 Mel和Vit E對(duì)CA引起的PP2A活性變化的影響 我們以前報(bào)道了Mel對(duì)OA和CA引起的神

18、經(jīng)細(xì)絲的過度磷酸化都有保護(hù)作用4,7，因此我們推測Mel對(duì)骨架蛋白磷酸化的保護(hù)作用可能與其升高PP2A活性有關(guān)。為了進(jìn)一步探討Mel 對(duì)CA引起的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化的保護(hù)機(jī)制，我們用32P特異底物標(biāo)記技術(shù)檢測PP2A活性。結(jié)果顯示：CA組細(xì)胞內(nèi)PP2A活性與正常對(duì)照組相比顯著降低(P<0.01)；25、50、100mol/L Mel處理組的PP2A活性與CA組相比均顯著升高(P<0.01)，但隨Mel濃度升高，PP2A活性升高程度降低；Vit E組的PP2A活性與CA組相比顯著降低(P<0.01)。結(jié)果提示低、中、高濃度Mel對(duì)CA誘導(dǎo)的PP2A活性降低均有保護(hù)作用，而Vit

19、 E對(duì)之無保護(hù)作用(圖2)。圖2 Mel和Vit E對(duì)CA誘導(dǎo)的PP2A活性降低的影響（略）2.3 Mel和Vit E對(duì)CA引起的細(xì)胞內(nèi)PP2A含量的影響 為進(jìn)一步探討Mel對(duì)抗CA引起的PP2A活性降低的機(jī)制。我們用識(shí)別PP2A的單克隆抗體R123d檢測細(xì)胞內(nèi)PP2A含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CA組的R123d顯色較正常對(duì)照組減弱(P<0.01)；25mol/L Mel組和50mol/L Mel組的R123d顯色強(qiáng)于CA組(P<0.01)；100mol/L Mel組和 Vit E組的R123d顯色與CA組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果表明CA顯著降低細(xì)胞內(nèi)PP2A水平，25、

20、50mol/L Mel可部分對(duì)抗CA引起的細(xì)胞內(nèi)PP2A水平降低(圖3)。 圖3 Mel和Vit E對(duì)CA誘導(dǎo)的PP2A含量降低的影響（略）3 討    論我國學(xué)者曾報(bào)道AD患者腦和腦脊液中磷酸化的NFH和NFM水平顯著升高， PP2A和PP1的特異性抑制劑OA處理人神經(jīng)瘤細(xì)胞SY5Y后，細(xì)胞出現(xiàn)了相似的結(jié)果。最近，我們發(fā)現(xiàn)PP2A和PP1的另一種抑制劑CA處理SY5Y細(xì)胞也可引起神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)CA處理N2awt細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)細(xì)絲發(fā)生過度磷酸化， PP2A含量顯著降低，但PP2A活性輕度降低。我們?cè)鴪?bào)道CA處理后，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)

21、明顯的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)GSK3活性顯著升高。根據(jù)報(bào)道，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物可激活GSK3引起tau蛋白過度磷酸化，我們認(rèn)為CA引起神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化的機(jī)理不僅與其降低PP2A含量和PP2A活性有關(guān)，而且還與其促進(jìn)氧化應(yīng)激有關(guān)。    Mel既具有脂溶性，也具有水溶性，容易通過血腦屏障進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞。研究表明，Mel可逆轉(zhuǎn)或阻斷OA引起的氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、骨架蛋白破壞。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)低、中、高濃度Mel均可部分對(duì)抗CA引起的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化，但高濃度Mel的對(duì)抗作用比低、中濃度的作用弱；同時(shí)，Mel還可升高PP2A活性，但隨Mel濃度升高

22、，其升高PP2A活性的作用減弱；Vit E雖降低PP2A活性，但也可部分對(duì)抗CA誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化。我們推測其可能原因?yàn)椋篤it E部分對(duì)抗CA引起的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化，從而對(duì)抗CA引起的GSK3活性升高；同時(shí)Vit E降低PP2A活性，又使Ser9磷酸化的GSK3去磷酸化減少，從而Ser9磷酸化的GSK3占總GSK3的比例升高，GSK3活性低于正常，進(jìn)而恢復(fù)GSK3/PP2A平衡，對(duì)抗CA引起的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化。具體機(jī)制尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。總之，本研究證明Mel對(duì)CA所致的神經(jīng)細(xì)絲過度磷酸化有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與Mel對(duì)抗CA誘導(dǎo)的PP2A含量及活性降低有關(guān)。參考文獻(xiàn)：1Ster

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