實驗五微生物培養(yǎng)基配制與滅菌

1、1.提供營養(yǎng)和條件2.防止污染一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質1.1.基本成分：基本成分：思考：微生物“吃”什么？碳源、氮源、水、無機鹽碳源、氮源、水、無機鹽碳源碳源無機碳源：無機碳源：有機碳源：有機碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物氮源氮源無機氮源：無機氮源：有機氮源：有機氮源：NHNH4 4、NONO3 3- -牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等一一. .培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：微生物生存的環(huán)境和營養(yǎng)物質微生物生存的

2、環(huán)境和營養(yǎng)物質1.1.基本成分：基本成分：碳源、氮源、水、無機鹽碳源、氮源、水、無機鹽2.2.特殊營養(yǎng)：特殊營養(yǎng)：維生素、生長因子等維生素、生長因子等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）3.pH3.pH、氧氣的需求：、氧氣的需求：細菌：6.5-7.5； 放線菌：7.5-8.5； 真菌：5.0-6.0。4.4.種類：種類：固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基有有無無 凝固劑瓊脂凝固劑瓊脂分離分離 鑒定鑒定工業(yè)工業(yè) 生產生產化學成分：化學成分：物理性質：物理性質：天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基微生物培養(yǎng)基的微生物培養(yǎng)基的配制與滅菌配制與滅菌目目 的的 要

3、要 求求1.1.明確培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制的明確培養(yǎng)基的配制原理和方法，掌握其配制的一般方法和步驟。一般方法和步驟。2.2.了解幾種滅菌方法，掌握了解幾種滅菌方法，掌握干熱滅菌法干熱滅菌法和和加壓蒸加壓蒸汽滅菌法汽滅菌法的原理及其使用方法。的原理及其使用方法。3.3.熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關準備工作及操熟悉分離、培養(yǎng)微生物前的有關準備工作及操作方法。（預習）作方法。（預習）培養(yǎng)基配制原則培養(yǎng)基配制原則目的明確：目的明確：營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當營養(yǎng)全面、濃度適宜、比例恰當適宜的適宜的pHpH值：值：有機碳源有機碳源異養(yǎng)型：異養(yǎng)型：根據微生物的根據微生物的種類、培養(yǎng)目的種類、

4、培養(yǎng)目的選擇原料選擇原料自養(yǎng)型：自養(yǎng)型： 不加碳源不加碳源加入緩沖劑加入緩沖劑細菌偏堿，真菌偏酸細菌偏堿，真菌偏酸（COCO2 2碳源）碳源）生產生產科研科研培養(yǎng)基的配制方法和步驟培養(yǎng)基的配制方法和步驟稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。稱量：按照配方正確稱取各種原料放于搪瓷杯中。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，溶解。溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒攪勻，溶解。調調pHpH值：用值：用1N NaOH1N NaOH或或1N HCl1N HCl調調pHpH，用，用pHpH試紙對照。試紙對照。加瓊脂溶化：加熱過程中要不斷攪拌，可適當補水。加瓊脂溶化：加熱過程中要不斷攪拌，可適當補水

5、。過濾過濾分裝分裝包扎，掛上標簽（滅菌指示條），注明何種培養(yǎng)基和配制時間。包扎，掛上標簽（滅菌指示條），注明何種培養(yǎng)基和配制時間。滅菌：滅菌：1211210 0C 20minC 20min倒置平板倒置平板檢查：培養(yǎng)基滅菌后必須在檢查：培養(yǎng)基滅菌后必須在37370 0C C下恒溫培養(yǎng)下恒溫培養(yǎng)24h24h，確定無菌生長，方，確定無菌生長，方可使用。可使用。按培養(yǎng)基按培養(yǎng)基配方稱量配方稱量加水加加水加熱熔化熱熔化調節(jié)調節(jié)pH值值過濾過濾分裝分裝包裝包裝滅菌滅菌檢查滅菌檢查滅菌徹底與否徹底與否培養(yǎng)基的配制和滅菌過程中的注意事項培養(yǎng)基的配制和滅菌過程中的注意事項1.1.蛋白胨很易吸濕，在稱取時蛋白胨很

6、易吸濕，在稱取時動作要迅速動作要迅速。l3.在瓊脂溶化過程中，應控制火力，以免培養(yǎng)基因沸在瓊脂溶化過程中，應控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時，騰而溢出容器。同時，需不斷攪拌需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒，以防瓊脂糊底燒焦，配制培養(yǎng)基時，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免焦，配制培養(yǎng)基時，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進入培養(yǎng)基中，影響細菌生長。離子進入培養(yǎng)基中，影響細菌生長。l4.pH不要調過頭不要調過頭，以免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的，以免回調而影響培養(yǎng)基內各離子的濃度。濃度。l5.分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免以免引起污染。引

7、起污染。l2.稱藥品時稱藥品時嚴防藥品混雜嚴防藥品混雜，一把牛交匙用于一種藥品，一把牛交匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品?；蚍Q取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯。瓶蓋也不要蓋錯。培養(yǎng)基培養(yǎng)基、玻璃器皿、玻璃器皿天平秤、天平秤、藥藥匙匙 以量桶量桶裝取適當量蒸蒸餾餾水水于玻璃容器中 于玻璃容器上標示培養(yǎng)基名稱 放上秤藥紙并歸零歸零 以秤藥匙舀出適當量培養(yǎng)基 (請看培養(yǎng)基罐上說明)傾倒培養(yǎng)基時小心不要沾到玻璃壁上 清理配藥桌面與天平 清洗秤藥匙，擦干放回 藥品放回藥品柜 調整分注器分注器 (Dispensette) 刻度 分裝試管 蓋上試管蓋6.6

8、.在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。l不能滅菌的物質：不能滅菌的物質： 1.爆炸性物質爆炸性物質l硝化丙烷硝化丙烷 、硝化甘油、硝化纖維，含氮硅酯。、硝化甘油、硝化纖維，含氮硅酯。 三硝基苯、三硝基甲苯、苦味酸、和其它爆炸性含氮三硝基苯、三硝基甲苯、苦味酸、和其它爆炸性含氮

9、復合物。復合物。l過醋酸過醋酸 、過氧化甲乙酮、過氧化苯甲酰和其它過氧化、過氧化甲乙酮、過氧化苯甲酰和其它過氧化有機物。有機物。 2.lgnitable 物質物質l金屬鋰、鉀、鈉、黃磷、氧化硫，和紅磷。金屬鋰、鉀、鈉、黃磷、氧化硫，和紅磷。培養(yǎng)基的配制和滅菌過程中的注意事項培養(yǎng)基的配制和滅菌過程中的注意事項實驗室的常用培養(yǎng)基：實驗室的常用培養(yǎng)基：細菌：細菌： 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；放線菌：高氏放線菌：高氏1 1號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；號合成培養(yǎng)基培養(yǎng)；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；酵母菌：麥芽汁培養(yǎng)基；霉菌：霉菌： 查氏合成培養(yǎng)基；查氏合成培養(yǎng)基； 牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨瓊脂培

10、養(yǎng)基: :用于分離和培養(yǎng)細菌用于分離和培養(yǎng)細菌的基礎培養(yǎng)基的基礎培養(yǎng)基，又稱天然培養(yǎng)基。，又稱天然培養(yǎng)基。 配方如下：配方如下： 牛肉膏牛肉膏 3 g 蛋白胨蛋白胨 10 g 氯化鈉氯化鈉 5 g 瓊脂瓊脂 20 g 自來水自來水 1000 mL pH 7.27.4 淀粉瓊脂培養(yǎng)基淀粉瓊脂培養(yǎng)基（高氏一號高氏一號），），用于分離和培用于分離和培養(yǎng)放線菌養(yǎng)放線菌，是一種合成培養(yǎng)基。，是一種合成培養(yǎng)基。 配方如下：配方如下： 可溶性淀粉可溶性淀粉 20.0 g KNO3 1.0 g K2HPO4 0.5 g MgSO4 7H2O 0.5 g NaCl 0.5 g FeSO4 7H2O 0.01 g

11、 瓊脂瓊脂 20 g 自來水自來水 1000 mL pH 7.47.6 查氏培養(yǎng)基查氏培養(yǎng)基，用于分離和培養(yǎng)霉菌用于分離和培養(yǎng)霉菌，是一種合成培養(yǎng)基。，是一種合成培養(yǎng)基。 配方如下：配方如下： NaNO3 2.0 g K2HPO4 1.0 g KCl 0.5 g MgSO4 0.5 g FeSO4 0.01 g 蔗糖蔗糖 30g 瓊脂瓊脂 20 g 自來水自來水 1000 mL pH 自然自然LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基培養(yǎng)基1000mlLB1000mlLB培養(yǎng)基的配方培養(yǎng)基的配方HH2 2O O 定容至定容至1000mL1000mL胰蛋白胨胰蛋白胨 (Tryptone) 10g(

12、Tryptone) 10g氯化鈉（氯化鈉（NaClNaCl） 10g10g瓊脂（瓊脂（agaragar） 15g15g酵母提取物酵母提取物(Yeastextract) 5g(Yeastextract) 5g20g20gYPD培養(yǎng)基培養(yǎng)基 for yeastfor yeast1000ml1000mlYPD培養(yǎng)基的配方培養(yǎng)基的配方HH2 2O O 定容至定容至1000mL1000mL蛋白胨蛋白胨 (peptone) 20g(peptone) 20g瓊脂（瓊脂（agaragar） 20g20g酵母提取物酵母提取物(Yeastextract) 10g(Yeastextract) 10g葡萄糖 1-2%

13、耐高溫需保持干燥的耐高溫需保持干燥的 物品，物品，160160170170 1-2 1-2小時小時接種環(huán)、接種針等接種環(huán)、接種針等 金屬用具金屬用具70757075、30min 30min 8080、15min15min100100、56min56min消毒消毒滅菌滅菌定義定義方法方法較為較為溫和溫和理化方法，理化方法，殺死殺死部分有害菌體部分有害菌體（不不包括芽孢、孢子）包括芽孢、孢子）強烈強烈的理化方法，的理化方法，殺死殺死所有微生物所有微生物（包括（包括芽孢、孢子芽孢、孢子）煮沸消毒法煮沸消毒法巴氏消毒法巴氏消毒法化學藥劑化學藥劑紫外線紫外線灼燒滅菌灼燒滅菌干熱滅菌干熱滅菌酒精、氯氣、石

14、炭酸等酒精、氯氣、石炭酸等高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基，培養(yǎng)基，100KPa100KPa、121121、151530min30min二二. .無菌技術：無菌技術：防止外來雜菌的污染防止外來雜菌的污染1.1.消毒與滅菌：消毒與滅菌：濕熱滅菌的優(yōu)點濕熱滅菌法菌體吸收水分蛋白質較易凝固濕熱的穿透力比干熱大，水的傳熱能力比許多非導體的固體強濕熱的蒸汽有潛熱存在，1g水在100由氣態(tài)變?yōu)橐后w態(tài)可放出2.26kJ，可增強滅菌效果培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法放入殺菌鍋殺菌鍋 (Autoclave) 滅菌加水蓋過鐵板放東西關門調整溫度時間關緊泄壓閥滅菌結束后，等壓力降回零壓力降回零時才可打開門進入殺菌釜 之物

15、品，蓋子不可關太緊或太松拿滅菌后物品請記得帶耐熱手套滅過菌之固態(tài)培養(yǎng)基于無菌操作臺無菌操作臺 (Laminar flow)內倒制平板培養(yǎng)基 (Plate)日光燈UV燈風扇培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法間歇滅菌法：間歇滅菌法： 待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮待滅菌的物品放在滅菌器或蒸籠里，每天蒸煮1 1次，每次煮沸次，每次煮沸1h1h，連續(xù)連續(xù)3d3d重復進行。在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在重復進行。在每兩次蒸煮之間，將物品（指培養(yǎng)基）放在37370 0C C恒溫條件下培養(yǎng)過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺死殘留的恒溫條件下培養(yǎng)過夜，這樣可以使每次蒸煮后未殺

16、死殘留的芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時殺滅。芽孢萌發(fā)成營養(yǎng)體，以便下次蒸煮時殺滅。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法過濾除菌法： 不能用加熱滅菌的液體物質（如維生素、血清），一般可用細菌過濾器進行除菌。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法紫外線滅菌法：紫外線滅菌法： 一般一般30W30W燈管，燈管，9m9m3 3空間，距地面空間，距地面2m2m每次打開紫外線照射每次打開紫外線照射0.5h0.5h，就使室內空氣滅菌。若照射紫外線時先噴灑石炭酸等化學消毒劑，就使室內空氣滅菌。若照射紫外線時先噴灑石炭酸等化學消毒劑，可增強滅菌效果。紫外線雖有較強的殺菌力，但穿透力弱，即使可增強滅菌效果。紫外線雖有較強的殺菌力，但穿

17、透力弱，即使一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣一薄層玻璃或水層就能將大部分紫外線濾除，因此只適用于空氣及表面殺菌。及表面殺菌。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法化學藥劑消毒滅菌：微生物實驗室中常用的化學殺菌劑有升汞、甲醛、高錳酸鉀、酒精、碘酒、龍膽紫、石炭酸、漂白粉、新潔爾滅、煤酚皂溶液，它們有的是殺菌劑，有的是抑菌劑。培養(yǎng)基和玻璃器材的滅菌方法本次實驗報告內容本次實驗報告內容記錄本實驗配制培養(yǎng)基的名稱、數量，并圖解說記錄本實驗配制培養(yǎng)基的名稱、數量，并圖解說明其配制過程，指明要點。明其配制過程，指明要點。思考題思考題固體培養(yǎng)基加瓊脂的作用是什么？固體培養(yǎng)基加瓊脂的作用是什么？干

18、熱滅菌和高壓蒸汽滅菌和有何不同？干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌和有何不同？培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌? ?若不若不能及時滅菌應如何處理能及時滅菌應如何處理? ?已滅菌的培養(yǎng)基如何進已滅菌的培養(yǎng)基如何進行無菌檢查行無菌檢查? ?無菌技術M的接種與分離技術微生物的培養(yǎng)方法微生物的生長現象與觀察（一）什么是無菌技術（一）什么是無菌技術指在微生物實驗工作中，控制或指在微生物實驗工作中，控制或防止各類微生物的污染及其干擾的一防止各類微生物的污染及其干擾的一系列操作方法和有關措施。系列操作方法和有關措施。（二）無菌環(huán)境（二）無菌環(huán)境無菌室無菌室無菌柜無菌柜超凈工作臺超

19、凈工作臺（1 1）無菌室的結構：更衣間、緩沖間、操作間）無菌室的結構：更衣間、緩沖間、操作間（2）無菌室的消毒和防污染無菌室的消毒和防污染每日（使用前）紫外線照射（每日（使用前）紫外線照射（1212小時）小時）. .每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（每周用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2 2小時）小時）. .每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒。 超凈臺的使用與保養(yǎng)超凈臺的使用與保養(yǎng): :（1 1）風速保持在）風速保持在0.32-0.480.32-0.48米米/ /秒秒; ;（2 2）使用前開啟紫外燈照射）使用前開啟紫外燈照射3030分鐘以上

20、分鐘以上; ;（3 3）讓超凈臺預工作）讓超凈臺預工作10101515分鐘分鐘; ;（4 4）使用完畢后，用）使用完畢后，用70%70%酒精將臺面和臺內酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈四周擦拭干凈. . （三）無菌器材（三）無菌器材滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等等. 消毒器材：無菌室內的凳子、試管架、消毒器材：無菌室內的凳子、試管架、天平、工作臺、手等天平、工作臺、手等（四）無菌操作（四）無菌操作1 1、目的：、目的：（1 1）是保證待檢物品不被環(huán)境中微生物的）是保證待檢物品不被環(huán)境中微生物的污染；污染；（2 2）是防止被檢微生物在操作中污染環(huán)境）是防止被檢

21、微生物在操作中污染環(huán)境或感染操作人員?；蚋腥静僮魅藛T。2 2、進入無菌室前的準備、進入無菌室前的準備（1 1）、定期檢查無菌環(huán)境的空氣是否符合）、定期檢查無菌環(huán)境的空氣是否符合規(guī)定；規(guī)定；（2 2）、用紫外線滅菌處理）、用紫外線滅菌處理30603060分鐘；分鐘；（3 3）、檢查無菌器材是否完備；）、檢查無菌器材是否完備；（4 4）、洗手消毒；）、洗手消毒；（5 5）、手部消毒后，再穿戴無菌工作服。）、手部消毒后，再穿戴無菌工作服。3、檢驗操作過程的無菌操作要求（1 1）、在操作中不應有大幅度或快速的動作；）、在操作中不應有大幅度或快速的動作；（2 2）、使用玻璃器皿應輕取輕放。）、使用玻璃器

22、皿應輕取輕放。（3 3）、在正火焰上方操作；）、在正火焰上方操作；（4 4）、接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；）、接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；（5 5）、在接種培養(yǎng)物時，協(xié)作應輕、準）、在接種培養(yǎng)物時，協(xié)作應輕、準。（6 6）、不能用嘴直接吸吹吸管。）、不能用嘴直接吸吹吸管。（7 7）、）、帶有菌液的吸管、玻片等器材應及時置于盛有帶有菌液的吸管、玻片等器材應及時置于盛有5%5%來蘇爾溶來蘇爾溶液的消毒桶內消毒。液的消毒桶內消毒。 無菌操作無菌操作斜面接種時的無菌操作(1)接種滅菌 (2)開啟棉塞 (3)管口滅菌 (4)挑起菌苔 (5)接種 (6)塞好棉塞1. 接種環(huán)前端鐵絲部分以酒精燈燒紅燒紅來來菌菌，后端鐵棒部分過火無菌操作 取菌技巧 12. 試管前端過火3. 打開試管蓋無菌操作 取菌技巧 14. 試管傾斜傾斜，放入接種環(huán)無菌操作 取菌技巧 15. 試管前端過火，蓋上試管蓋6. 接種環(huán)燒紅滅菌無菌操作 取菌技巧 15. 試管前端過火，蓋上試管蓋6. 接種環(huán)燒紅滅菌無菌操作 取菌技巧 12. 自 Plate 上取單一菌落 (方法一：蓋子微開遮住培養(yǎng)基，避免空氣中菌體掉入)(方法二：plate 反面拿起)無無菌操作菌操作 取菌技巧取菌技巧 2 21. 擠出安全吸安全吸球球內空氣，插上滅過菌之玻璃吸管2.