腺苷對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用_圖文

1、研究論文腺苷對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用王興祥1,3,周利龍1,丁家望2,馮義柏1,程龍獻(xiàn)11華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心內(nèi)科,武漢430022;2宜昌市中心人民醫(yī)院,宜昌443000摘要:本研究旨在探討腺苷(adenosine,ADO對(duì)缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation,H/R心肌細(xì)胞的保護(hù)作用及其分子機(jī)制。將原代培養(yǎng)的新生大鼠心肌細(xì)胞分成H/R對(duì)照組和ADO(110mol/L保護(hù)組。用倒置相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。檢測(cè)兩組培養(yǎng)基質(zhì)乳酸脫氫酶(LDH活性和心肌細(xì)胞Ca2+和丙二醛(MDA濃度。用EL ISA法檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF2的表達(dá),并用凝膠電泳

2、遷移率改變法(EMSA測(cè)定核因子(NF2B結(jié)合活性。所得結(jié)果如下:(1心肌細(xì)胞H/R培養(yǎng)后皺縮、變圓,偽足減少,ADO組心肌細(xì)胞的形態(tài)變化小于對(duì)照組;(2 ADO減少缺氧和復(fù)氧期間心肌細(xì)胞LDH的漏出(both P<0101;(3ADO降低缺氧和復(fù)氧期間心肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度(both P<0101;(4ADO降低缺氧和復(fù)氧期間心肌細(xì)胞MDA濃度(both P<0101;(5ADO抑制缺氧和復(fù)氧期間TNF2的表達(dá)(both P<0101;(6ADO抑制缺氧和復(fù)氧期間心肌細(xì)胞NF2B結(jié)合活性(both P<0101。以上結(jié)果提示:(1外源性ADO可減輕心肌細(xì)胞的H

3、/R損傷;(2外源性ADO抑制H/R期間心肌細(xì)胞TNF2的表達(dá);(3外源性ADO可能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞NF2B結(jié)合活性下調(diào)TNF2的表達(dá)。關(guān)鍵詞:腺苷;缺氧/復(fù)氧損傷;心肌細(xì)胞中圖分類號(hào):Q463;R540Adenosine protects cardiomyocytes from hypoxia/reoxygenation injuryWAN G Xing2Xiang1,3,ZHOU Li2Long1,DIN G Jia2Wang2,FEN G Y i2Bai1,CHEN G Long2Xian1 1Depart ment of Cardiology,U nion Hospital A f f

4、 iliated to Tongji Medical College,Huaz hong U niver2 sity ofScience and Technology,W uhan430022;2Yichang People Hospital,Yichang443000Abstract:The aim of this study was to investigate the protective effect of adenosine(ADOon car2 diomyocytes following hypoxia/reoxygenation(H/Rand its molecular mech

5、anism.Primary cultured cardiomyocytes of neonatal rats were divided into two groups,namely H/R(controland ADO(110mol/Lgroups.The morphologic changes in cardiomyocytes were observed under an inverted phase2 contrast microscope.The following parameters of the two groups were determined:lactate dehydro

6、ge2 nase(LDHactivity,intracellular calcium concentration and malondialdehyde(MDAcontent.Tumor necrotic factor(TN F2assay was performed using an EL ISA kit and N F2B in the nucleus was analyzed by electrophoretic mobility shift assay(EMSA.The results are as follows:(1after H/R injury,car2 diomyocytes

7、 contracted,tending to get round in shape and its pseudopods decreased,while marked mor2 phological changes were not observed in ADO group;(2LDH leakage maintained at a lower level in ADO group than that in the control group during H/R(both P<0101;(3ADO significantly reduced the concentration of

8、calcium in cells and prevented calcium overload during H/R(both P<0101;(4 ADO markedly reduced the content of MDA during H/R(both P<0101;(5ADO inhibited the pro2 duction of TN F2during H/R(both P<0101;and(6ADO down2regulated N F2B binding activity of cardiomyocytes during H/R(both P<0101

9、。The results suggest that(1exogenous ADO attenuatesReceived2002205207Accepted20022082263Corresponding author.Present address:Cardiovascular Disease Department,First Affiliated Hospital,Medical School of Zhejiang University, Hangzhou310003,China.Tel:+86257528061397;E2mail:wangxx19730312yahoo1com1cnH/

10、R injury of cultured cardiomyocytes;(2exogenous ADO inhibits the production of TN F2after H/R injury;(3exogenous ADO prevents the activation of N F2B,which may be the molecular mechanism of down2regulation of TN F2expression.K ey w ords:adenosine;hypoxia/reoxygenation injury;cardiomyocytes腺苷(adenosi

11、ne,ADO作為心肌細(xì)胞的能量代謝產(chǎn)物,在缺血預(yù)處理的心臟保護(hù)中具有重要作用。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),ADO可下調(diào)人和大鼠缺血心肌組織腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor2,TN F2的表達(dá),而TN F2是中性粒細(xì)胞介導(dǎo)缺血/再灌注損傷的主要細(xì)胞因子1。目前對(duì)ADO下調(diào)TN F2表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚。有作者報(bào)道,心肌組織缺血/再灌注時(shí),核因子B(nuclear factorB, N F2B活性持續(xù)增高24,且最近有研究表明ADO可抑制離體心臟缺血/再灌注時(shí)的N F2B活性5。而后者參與了一系列炎癥因子的表達(dá)調(diào)控,包括TN F2。本文通過(guò)觀察外源性ADO對(duì)缺氧/復(fù)氧(hypoxia/

12、reoxygenation,H/R心肌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)、損傷指標(biāo)、TN F2表達(dá)及N F2B活性的影響,進(jìn)一步從細(xì)胞水平明確ADO的心臟保護(hù)作用及其機(jī)制,并初步探討心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷時(shí)TN F2與N F2B活性的關(guān)系,為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。1材料和方法111主要試劑和儀器胎牛血清和DM EM合成培養(yǎng)基購(gòu)自G ibco公司。胰蛋白酶(trypsin購(gòu)自Difco公司。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH試劑盒購(gòu)自上海申能生物技術(shù)有限公司。丙二醛(malondialdehyde,MDA和TN F2EL ISA試劑盒購(gòu)自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司。N F2B寡核苷

13、酸序列、T4多核苷酸激酶、T4激酶緩沖液均購(gòu)自Promega公司。232PA TP購(gòu)自北京福瑞公司。ADO購(gòu)自Sigma公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自德國(guó)Heraeus公司;倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。112新生大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)取新生14 d SD大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供的心室肌組織并剪碎,用011%胰蛋白酶分次消化,分離心肌細(xì)胞。用含10%胎牛血清、100U/ ml青霉素、100g/ml鏈霉素的DM EM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液,以差速貼壁法純化心肌細(xì)胞,使純度達(dá)到90%以上。以115×106/ml接種于預(yù)先用50 mg/L多聚賴

14、氨酸涂布過(guò)的培養(yǎng)瓶中,瓶中置蓋玻片供細(xì)胞貼附生長(zhǎng),在37、95%O2+5%CO2的二氧化碳孵箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每2d更換一次培養(yǎng)基,取培養(yǎng)4d的單層細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。113H/R損傷模型的建立將心肌細(xì)胞用缺氧缺糖培養(yǎng)基培養(yǎng)后,培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)立即充入215%O2+ 9215%N2+5%CO2(1L/min持續(xù)90s,以驅(qū)除瓶?jī)?nèi)氧氣,37密閉培養(yǎng)2h。將缺氧的心肌細(xì)胞換用飽含95%O2+5%CO2的含糖培養(yǎng)基,在正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1h,建立缺氧/復(fù)氧損傷模型。114實(shí)驗(yàn)分組將培養(yǎng)的單層心肌細(xì)胞分為2組: (1對(duì)照組:按照上述方法,制備缺氧/復(fù)氧損傷模型;(2ADO處理組:在培養(yǎng)基中加入ADO(110mol/L后

15、,立即按對(duì)照組程序處理。各組均缺氧培養(yǎng)2h后再給氧1h。收集缺氧前、缺氧后2h、再給氧1h后的培養(yǎng)基和心肌細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定。各組均在上述心肌細(xì)胞培養(yǎng)條件下培養(yǎng)3批細(xì)胞并做6份重復(fù)測(cè)試。115心肌細(xì)胞的鑒定心肌細(xì)胞的鑒定采用免疫組織化學(xué)方法。116心肌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的檢測(cè)心肌細(xì)胞復(fù)氧1 h后,利用倒置相差顯微鏡觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變,用臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)心肌細(xì)胞的存活率。117LD H測(cè)定取心肌細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì),用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)LDH。用紫外吸收法測(cè)定培養(yǎng)介質(zhì)的蛋白質(zhì)含量,計(jì)算細(xì)胞外液LDH比活性。LDH比活性(U/mg=LDH活性(U/L/蛋白質(zhì)含量(mg/L。118細(xì)胞內(nèi)鈣含量的測(cè)定

16、采用原子吸收分光光度法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣含量。119MDA測(cè)定收集心肌細(xì)胞并用超聲粉碎后,離心取上清。按試劑盒配制溶液,以015nmol/L的四乙氧基丙烷為標(biāo)準(zhǔn)品,測(cè)定吸光度并進(jìn)行計(jì)算。1110TNF2的測(cè)定按試劑盒要求,采用雙抗體夾心EL ISA方法測(cè)定心肌細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子。本法測(cè)定TN F2的最低檢測(cè)限為8ng/L,以O(shè)D值對(duì)濃度作線性回歸,回歸方程為OD=01118C +21124(r=019998。1111NF2B結(jié)合活性的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)采用電泳遷移率改變法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA測(cè)定核因子B結(jié)合活性。(1核蛋白的提取與濃度測(cè)定

17、:收集心肌細(xì)胞,將其在緩沖液中勻漿,2000×g離心10min,棄上清。將沉淀重懸于緩沖液并劇烈震蕩后,4000×g 離心10min ,棄上清。再將沉淀懸于緩沖液吹打混勻,14000×g 離心30min ,取上清。用考馬斯亮藍(lán)方法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,并置于液氮中保存。(2探針的標(biāo)記與純化:N F 2B 結(jié)合序列:52A GTTG A GGGG ACTTTCCC 2A GGC 23。在消毒的離心管中混合以下試劑:N F 2B 寡核苷酸序列、緩沖液、232P A TP 、去離子水和T4多核苷激酶,置于37保溫10min 后,加入ED TA 終止反應(yīng)。將反應(yīng)后DNA 樣品用

18、G 225凝膠過(guò)濾柱層析,以除去未結(jié)合的小分子232P A TP 。(3建立結(jié)合反應(yīng)體系:在消毒離心管中混合緩沖液、核蛋白、標(biāo)記的N F 2B 序列和去離子水。將結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)物加入上樣緩沖液,上樣至5%非變性聚丙烯酰胺凝膠,以恒電壓150V 進(jìn)行電泳分離。當(dāng)指示劑溴酚藍(lán)行至凝膠下緣時(shí),終止電泳,移開(kāi)玻璃塊,用3M 的Whatman 濾紙揭膠,并且在膠上覆蓋saran 塑料膜。將膠及X 光片置于暗盒內(nèi),-20曝光2428h ,進(jìn)行放射自顯影和定影,并用MPIAS 型多媒體圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行密度掃描。1112統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean ±SD 表示,用SAS 軟件包作成組t 檢驗(yàn)處理,計(jì)算P

19、 值,并設(shè)類錯(cuò)誤=0101。2結(jié)果211心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞(圖1A 呈梭形或不規(guī)則三角形,核呈卵圓形并居中,搏動(dòng)規(guī)則,頻率為80120次/min ,細(xì)胞存活率9515±311%;缺氧復(fù)氧損傷組心肌細(xì)胞(圖1B 皺縮變圓,偽足減少,大多搏動(dòng)停止,細(xì)胞存活率降至6112±217%(P <0101;ADO 組心肌細(xì)胞(圖1C 的形態(tài)變化明顯小于缺氧復(fù)氧損傷組,生長(zhǎng)較好,細(xì)胞存活率為8816±219%,明顯高于對(duì)照組(P <0101 。圖1.腺苷對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響Fig 11.Protective effects of ADO on

20、cultured cardiomyocyte.A :Myocytes in normal condition.B :Myocytes injured by H/R.C :Myocytes (H/R pretreated with ADO.Scale bar ,30m.94王興祥等:腺苷對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用212心肌細(xì)胞膜通透性心肌細(xì)胞膜通透性以LDH從心肌細(xì)胞的漏出來(lái)衡量。正常培養(yǎng)條件下,心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中LDH 的水平較低,與ADO組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0105。對(duì)照組缺氧2h時(shí),LDH漏出顯著增加(P<0101,但低于復(fù)氧1h時(shí)的水平(P<0101,提示復(fù)氧可

21、以進(jìn)一步損傷心肌細(xì)胞膜。ADO處理組缺氧2h和復(fù)氧1h時(shí)LDH濃度均明顯低于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)的濃度(both P<0101,提示在缺氧和復(fù)氧的過(guò)程中,ADO均可保護(hù)心肌細(xì)胞膜(表1。213細(xì)胞內(nèi)鈣含量正常培養(yǎng)條件下,心肌細(xì)胞鈣含量較低,對(duì)照組與ADO處理組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0105。對(duì)照組缺氧2h時(shí),細(xì)胞內(nèi)鈣含量顯著增加(P< 0101,但低于復(fù)氧1h時(shí)的水平(P<0101,提示復(fù)氧進(jìn)一步增加胞內(nèi)鈣濃度。腺苷處理組缺氧2h 和復(fù)氧1h時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣含量明顯低于對(duì)照組(both P<0101,提示在缺氧和復(fù)氧的過(guò)程中,腺苷均可限制心肌細(xì)胞的鈣超載(表1。214心肌細(xì)胞

22、脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)MDA是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物,本文以其高低反映心肌細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)水平。正常培養(yǎng)條件下,心肌細(xì)胞MDA的水平較低,與ADO組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0105。對(duì)照組缺氧2h時(shí),MDA漏出顯著增加(P<0101,但低于復(fù)氧1h時(shí)的水平(P<0101,提示復(fù)氧進(jìn)一步增強(qiáng)細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。ADO處理組缺氧2h和復(fù)氧1h時(shí)MDA濃度均明顯低于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)的濃度(both P<0101,提示在缺氧和復(fù)氧的過(guò)程中, ADO均可抑制心肌細(xì)胞的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)(表1。表1.腺苷對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞LDH漏出、鈣濃度、MDA含量、TNF2表達(dá)和NF2B結(jié)合活性的影

23、響Table11Effects of ADO on LDH leakage,calcium concentration,MDA content,TNF2production and NF2B binding activity of cultured cardiomyocytes injured by hypoxia/reoxygenationGroupLDH(U/mgCalcium(ng/mg proteinMDA(nmol/LTNF2(ng/LNF2BNormalControl33111±516666145±51880147±0106916±21130

24、17±613 ADO34176±513767133±71650145±0107914±2133116±517 HypoxiaControl146176±1718#123187±11143#0189±0111#2816±718#5718±818# ADO87145±8197387144±618830152±010431615±21933414±5183 Reoxygenation215ADO對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞TNF2表達(dá)的影響正常培養(yǎng)條

25、件下,心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中TN F2的水平較低,與ADO組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P> 0105。對(duì)照組缺氧2h時(shí),TN F2濃度顯著增加(P<0101,但低于復(fù)氧1h時(shí)TN F2的水平(P< 0101,提示復(fù)氧可以進(jìn)一步上調(diào)TN F2的表達(dá)。ADO處理組缺氧2h和復(fù)氧1h時(shí)TN F2濃度均明顯低于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)的濃度(both P<0101,提示在缺氧和復(fù)氧的過(guò)程中,ADO均可抑制TN F2的生成(表1。216ADO對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞NF2B結(jié)合活性的影響正常培養(yǎng)條件下心肌細(xì)胞N F2B DNA結(jié)合活性很低,與ADO組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0105。對(duì)照組缺氧2h時(shí),N

26、 F2B活性顯著增加(P< 0101,但低于復(fù)氧1h時(shí)的水平(P<0101,說(shuō)明復(fù)氧進(jìn)一步激活N F2B。ADO處理組缺氧2h和復(fù)氧1h時(shí)N F2B活性均明顯低于對(duì)照組(both P< 0101,說(shuō)明在缺氧和復(fù)氧的過(guò)程中,ADO均可阻止N F2B激活(表1和圖2。3討論311心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧模型細(xì)胞是生物體結(jié)構(gòu)和功能的基本單位,各種生命活動(dòng)均以細(xì)胞為基礎(chǔ)而完成。細(xì)胞培養(yǎng)作為基礎(chǔ)研究技術(shù)之一,以其簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、可靠和便于控制等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。本05生理學(xué)報(bào)Acta Physiol.Si n.,February25,2003,55(1:4752圖2.腺

27、苷抑制缺氧/復(fù)氧損傷心肌細(xì)胞的NF2B結(jié)合活性Fig12.ADO inhibits NF2B biding activity in cultured car2 diomyocytes injured by H/R.Lane normal:myocytes in nor2 mal condition;lane H/R:reoxygenatin myocytes in control group;lane ADO+H/R:reoxygenation myocytes in ADO group;lane H:hypoxia myocytes in control group;lane ADO +H:

28、hypoxia myocytes in ADO group.實(shí)驗(yàn)在大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的模型。心肌細(xì)胞經(jīng)2h缺氧,1h復(fù)氧后,搏動(dòng)減弱甚至停止,膜通透性增加,胞內(nèi)鈣超載,脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)增強(qiáng)。心肌細(xì)胞這些結(jié)構(gòu)和功能的改變與心臟缺血/再灌注損傷的結(jié)果基本相似,提示心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧損傷可較為真實(shí)地模擬了心臟缺血/再灌注損傷的病理生理過(guò)程。312ADO的心肌保護(hù)效應(yīng)內(nèi)源性ADO是一種調(diào)節(jié)心臟功能的主要活性物質(zhì),尤其當(dāng)心肌組織能量供應(yīng)障礙時(shí)。本文結(jié)果提示ADO可減輕心肌細(xì)胞的H/R損傷:(1ADO 組心肌細(xì)胞形態(tài)變化較小,生長(zhǎng)良好;(2缺氧和復(fù)氧過(guò)程中,ADO均

29、可減少細(xì)胞內(nèi)LDH的漏出;(3 ADO降低心肌細(xì)胞鈣含量,抑制胞內(nèi)鈣超載;(4 ADO減弱心肌細(xì)胞缺氧和復(fù)氧期間的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。通過(guò)觀察外源性ADO對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響,從細(xì)胞水平直觀地認(rèn)識(shí)了ADO對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用,為臨床應(yīng)用外源性ADO作為缺血心臟的保護(hù)劑提供了理論依據(jù)。313ADO下調(diào)TNF2表達(dá)TN F2是一種具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子,參與了多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展,尤其在心肌缺血/再灌注損傷中具有重要作用。除胞內(nèi)鈣超載和氧化應(yīng)激外,中性粒細(xì)胞是再灌注損傷的主要效應(yīng)細(xì)胞,可與血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附并釋放顆粒狀彈性硬蛋白酶和活性氧,引起內(nèi)皮細(xì)胞及其間質(zhì)的損害。TN F2作用

30、于心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞間粘附分子,促使中性粒細(xì)胞粘附而介導(dǎo)缺血/再灌注損傷6。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:正常培養(yǎng)條件下,心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中TN F2水平較低,H/R刺激明顯提高TN F2水平。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn),ADO可下調(diào)人和大鼠缺血心肌組織TN F2的表達(dá),也可抑制脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞或巨噬細(xì)胞TN F2的生成711。本文從培養(yǎng)心肌細(xì)胞的角度直接證實(shí)了外源性ADO可抑制H/R心肌細(xì)胞TN F2的表達(dá)。314ADO抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的NF2B生理情況下,N F2B與其抑制蛋白IB結(jié)合在一起,以非活化形式存在。心肌缺血/再灌注時(shí),胞漿IB濃度顯著下降,N F2B活性持續(xù)增高24。激活的N F2B轉(zhuǎn)

31、位至核內(nèi),與靶基因的B序列結(jié)合,增強(qiáng)后者轉(zhuǎn)錄,繼而調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、粘附分子、免疫受體、轉(zhuǎn)錄因子、氧化應(yīng)激相關(guān)酶和急性期蛋白等的表達(dá),介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞激活,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,加重了心肌組織的缺血/再灌注損傷。N F2B作為缺血/再灌注過(guò)程中多種內(nèi)皮細(xì)胞激活分子的匯聚點(diǎn),有可能成為防治缺血/再灌注損傷的理想靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧模型,測(cè)定了心肌細(xì)胞N F2B的結(jié)合活性。結(jié)果提示,在正常培養(yǎng)條件下,心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中N F2B的活性較低,而缺氧/復(fù)氧刺激可使其活性明顯增高。外源性ADO顯著抑制心肌細(xì)胞缺氧和復(fù)氧過(guò)程中N F2B的結(jié)合活性,這可能是其對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)

32、氧損傷保護(hù)效應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制之一。ADO抑制N F2B 的結(jié)合活性可能與下例途徑有關(guān):(1ADO抑制缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生;(2ADO直接抑制IB激酶的活性,提高胞漿IB水平。315NF2B與TNF2的關(guān)系心肌缺血/再灌注時(shí)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)活化的N F2B與IB解離后轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi),與含有特定DNA 序列5GGGRNN YYCC3的TN F2基因的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子結(jié)合,促進(jìn)該基因轉(zhuǎn)錄并翻譯。而抗氧化15王興祥等:腺苷對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用 52 生理學(xué)報(bào) A cta Physiol . S i n . , February 25 , 2003 , 55 (1 : 4752 劑 D TC

33、 可抑制心肌缺血/ 再灌注引起的 N F2 B 活 化 , 故認(rèn)為氧化應(yīng)激可能是 N F2 B 活化的關(guān)鍵因 素 。結(jié)合本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果和以往文獻(xiàn) , 我們推測(cè)外源 性 ADO 對(duì) TN F2 的影響可能通過(guò)減少氧自由基的 生成 , 繼而抑制 N F2 B 的途徑完成 12 。 值得一提的是 , TN F2 可磷酸化 氨基端調(diào) IB 節(jié)區(qū)第 32 和 36 位絲氨酸殘基 , 誘導(dǎo) 降解 , 從 IB 而激活 N F2 B 。在小鼠心臟再灌注早期 , TN F2 通 13 過(guò)激活 N F2 B 加重缺血/ 再灌注損傷 。也就是 說(shuō) , 在心肌缺血/ 再灌注過(guò)程中 TN F2 和 N F2 B 之 間

34、可能存在正反饋?zhàn)饔?, 這需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí) 。 參 考 文 獻(xiàn) 1 Winn R K , Ramamoort hy C , Vedder NB , Sharar SR , Harlan J M. Leukocyte2endot helial cell interactions in is2 chemia2reperfusion. Ann N Y Acad Sci 1997 ;832 :311 321. 2 Li C , Browder W , Kao RL . Early activation of tran2 scription factor N F2kappaB during ische

35、mia in perfused rat heart . Am J Physiol 1999 ;276 : H543 H552. 3 Chandrasekar B , Smit h JB , Freeman GL . Ischemia 2 reperfusion of rat myocardium activates nuclear factor2 KappaB and induces neutrop hil infiltration via lipopolysaccharide2induced CXC chemokine. Circulation 2001 ;103 :22962302. 4

36、C , Kao RL , Ha T , Kelley J , Browder IW , Williams Li DL . Early activation of I KKbeta during in vivo myocar2 dial ischemia. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2001 ; 280 : H1264 H1271. 5 Chuanfu L , Tuanzhu H , Liping L , William B , Race L K. Adenosine prevents activation of transcription factor N

37、 F2 B and enhances activator protein21 binding activity in ischemic rat heart . Surgery 2000 ; 127 :161169. 6 Bevillacqua MP. Endot helial2leukocyte adhesion molecules. Annu Rev Immunol 1993 ; 11 :768804. 7 Meldrum DR , Cain BS , Cleveland J C J r , Meng X , Ay2 ala A , Banerjee A , Harken AH. Adeno

38、sine decreases post2ischemic myocardial TN F2 anti2inflammatory impli2 cations for preconditioning and transplantation. Im2 munology 1997 ; 92 : 472477. 8 Cain BS , Meldrum DR , Dinarello CA , Meng X , Baner2 jee A , Harken AH. Adenosine reduces cardiac TN F 2 production and human myocardial injury following is2 chemia2reperfusio