高效液相色譜法測定虎杖中白藜蘆醇的含量(共7頁)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上反相高效液相色譜法測定虎杖中白藜蘆醇的含量白祖海，文剛，張艷（長沙市疾病預(yù)防控制中心，長沙 ）摘要：采用HPLC法測定虎杖中白藜蘆醇含量。以聚酰胺柱對樣品進(jìn)行預(yù)處理，排除其它成分的干擾，獲得較好分離度和高回收率。選用自填裝 ODS-C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5m)，以乙醇-水(2：3,v/v)作流動(dòng)相，流速為0.6 ml/min，紫外光檢測波長304nm，柱溫為25。白藜蘆酵在0.05-0.40g/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。r=0.9996，平均回收率為98.51%(n=5)。結(jié)論：該方法簡便、準(zhǔn)確可靠，適合于中藥材虎杖中白藜蘆醇含量的

2、測定。關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；虎杖；反相高效液相色譜法Determination of Resveratrol in the Polygonum Cuspidatum by HPLCBAI Zu-hai, WEN Gang, ZHANG Yan(Changsha Municipal Center for Prevention and Control of Diseases, Changsha , China)Abstract：A simple and sensitive HPLC method for the determination of resveratrol in the roots of

3、Polygonum cuspidatum was described，including the pretreatment of samples by poamide colutah. The separation was performed on an ODS column(200 mm×4.6 mm，5m)，with the mobile phase of CH3CH2OH-H2O (2：3,v/v).The flow rate 0.6 ml/min and the detection wavelength was 304 nm，the temperature of the pi

4、llar is indoor temperature. Resveratrol have good linear relationship in the range of 0.05-0.40g (r=0.9996).The average recoveries(n=5)of resveratrol were98.51%.A simple，accurate and sensitive method with good reproduciability to determine resveratrol simultaneously in Polygonum cuspidatum Sieb.et Z

5、ucc.is establishedKeywords：Resveratrol；Polygonum cuspidatum； HPLC.虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc)是蓼科蓼屬植物，廣泛分布于華東、中南、遼陜甘川滇等地。虎杖根莖中主要含有蒽醌類和芪類化合物，其中芪類成收稿日期：2011-09-28修訂日期：2012-07-20作者簡介：白祖海（1978），男，湖南岳陽人，長沙市疾病預(yù)防控制中心，主管檢驗(yàn)師，碩士學(xué)位分白藜蘆醇(resveratro1)和白藜蘆醇苷(piceid)，具有活血定痛、清熱利濕、止咳化痰作用 1。白藜蘆醇具有抗氧化、抗癌、抗血小板

6、凝聚、抗菌、調(diào)節(jié)脂類代謝、保護(hù)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等多種功能2，被列為抗心血管病、抗癌最有前途的藥物之一?；⒄戎邪邹继J醇含量最高3。目前對白藜蘆醇的測定方法不少4,5，主要有分光光度法6、 膠束薄層色譜法7、電化學(xué)發(fā)光法8、高速逆流色譜法8-9、高效液相色譜法10-11等。建立準(zhǔn)確可靠和簡便的測定虎杖中白藜蘆醇的含量方法對于虎杖資源的充分開發(fā)利用產(chǎn)生重要的實(shí)際意義，為其研究開發(fā)提供科學(xué)的依據(jù)。本研究對虎杖樣品進(jìn)行初步處理，以乙醇-水為流動(dòng)相，建立了測定虎杖中白藜蘆醇的反相高效液相色譜方法，該測定方法操作簡單，測定結(jié)果穩(wěn)定可靠。1 實(shí)驗(yàn)部分1.1 儀器與試劑HLPC Pump裝柱機(jī)（BT3020

7、，德國）；高效液相色譜儀（安捷倫，1200系列，美國），RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；WF-4000微波系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）；高頻數(shù)控超聲波發(fā)生器(KQ80TDB型, 昆山市超聲儀器有限公司), FA2104型電子天平。 乙醇(色譜純，湖南師大試劑廠)；乙醇(化學(xué)純，湖南師大試劑廠)；乙酸乙酯（分析純，和氏璧化工）；白藜蘆醇對照品(美國Sigma公司，純度99)；虎杖藥材購自湖南九芝堂藥材公司。1.2 溶液的制備1.2.1 對照品溶液的配制稱取白藜蘆醇2.5 mg，置25ml容量瓶中，乙醇溶解，并稀釋至刻度。搖勻，得含白藜蘆醇0.10 mg/ml 的混合對照品儲(chǔ)備液

8、，冷藏備用。1.2.2 虎杖的預(yù)處理 根據(jù)虎杖中自藜蘆醇、 白藜蘆醇苷和大黃素的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的差異， 采用乙醇溶液超聲提取，利用極性適中的乙酸乙酯再提取，三種組分的回收率比較高。提取結(jié)果表明：采用乙醇超聲初提取和乙酸乙酯二次提取比單獨(dú)采用乙醇浸提或回流提取的回收率高。如最后采用氯仿提取，乳化現(xiàn)象較嚴(yán)重，且結(jié)果與乙酸乙酯提取相比較差。可以同時(shí)測定白藜蘆醇、白藜蘆醇苷和大黃素的含量，并防止白藜蘆醇苷水解。1.2.3 樣品溶液的制備本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)的加熱回流方法提取白藜蘆醇來建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：虎杖粉末過4 0目篩，精密稱取虎杖粉末5 0 g，用95%乙醇水浴回流提取三次，第一次用250ml乙醇回流提取3h，

9、第二、三次分別用200ml乙醇回流提取各lh，合并提取液,冷卻,過濾,濾液減壓濃縮至月50ml后加蒸餾水200 ml，水浴揮發(fā)去殘余乙醇，保溫30min后過濾。濾液上聚酰胺柱，大量蒸餾水沖至無色后，用l0%乙醇沖洗，待顏色沖淡后用3 0%乙醇沖洗，收集3 0%乙醇沖洗液，減壓蒸餾濃縮并定容于100 ml容量瓶中，精密吸取上述溶液 l ml，置10ml容量瓶中，乙醇稀釋至刻度。為了對比常規(guī)的加熱回流方法提取白藜蘆醇提取率的不同，本文還采用微波法來提取白藜蘆醇：虎杖粉末預(yù)處理后過4 0目篩，精密稱取虎杖粉末5 0 g，用95%乙醇浸泡1h后，在功率600W下微波處理5次，每次1min，間歇時(shí)間為2

10、min，使提取溫度不超過30oC。微波處理后余下的步驟與加熱回流方法一致。圖1 白藜蘆醇對照品和樣品液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms for standard resveratrol and extraction solution of Polygonum cuspidatum 2 結(jié)果與討論2.1 色譜條件色譜柱：選用ODS-C18色譜柱(200 mm×4.6 mm，5m)；流動(dòng)相：乙醇-水(2:3，v/v)；流速：0.6 ml·min-1；檢測波長：304 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量l0l。在此條件下，作白藜蘆醇對照品色譜圖。樣品溶液以相同條件

11、進(jìn)樣，根據(jù)對照品白藜蘆醇的保留時(shí)間初步確定樣品溶液中白藜蘆醇的特征峰。白藜蘆醇的出峰時(shí)間為3.05min，與其他組分的色譜峰可以達(dá)到基線分離。此條件下白藜蘆醇的理論塔板數(shù)均不低于3000。對照品及樣品液相色譜圖見圖1。2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取混合對照品儲(chǔ)備液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，置10ml容量瓶中，乙醇稀釋至刻度，制成不同濃度的混合對照品溶液。按“2.2色譜條件”測定峰面積積分值，以峰面積積分值Y為縱坐標(biāo)，對照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。白藜蘆醇的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)為：Y= 9.464×10 -5X+ 0.225式中，

12、X為白藜蘆酸質(zhì)量濃度，單位為g/mL； Y為色譜峰面積，單位為mm2，線性回歸系數(shù)r=0.9996，最小檢出限為10ng/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，白藜蘆醇在0.05-0.40g/ml 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。 2.3 虎杖中白藜蘆醇含量測定對同一批藥材精密稱取5份，按2.1溶液配制方法制備樣品溶液。將制備好的待測溶液按上述色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)峰面積計(jì)算該樣品溶液中白藜蘆醇的含量。計(jì)算公式為n=(a/b)×100%。其中n為白藜蘆醇的含量(g)；a為白藜蘆醇質(zhì)量(g)；b為虎杖粗粉的質(zhì)量(g)。計(jì)算平均值得到虎杖中白藜蘆醇的含量為0.3500%（見表1）。表1 虎杖中白藜蘆醇含量的測定Tab

13、. 1 Determination of Resveratrol in the Polygonum Cuspidatum序 號加入量（g）白藜蘆醇（%）120.00250.3501220.04720.3496320.03650.3502419.98940.3498520.01480.35042.4 加樣加標(biāo)回收試驗(yàn)依次配制白藜蘆醇對照品溶液、樣品溶液和樣品加對照品溶液，按上述方法測定其含量。將所得的5份供試品溶液按“色譜條件”項(xiàng)下進(jìn)行測定，每份樣品測定5次，計(jì)算加樣回收率。測得平均回收率為98.51%；相對誤差（RSD）為0.2279%，回收效果很好(見表2)。表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab. 2

14、 Result of recovery ratio序 號加入量（g）測得量（g）回收率（%）平 均回收率相對誤差13.203.1698.7598.51%0.2279%27.407.3198.78311.2011.0398.48416.2015.9798.58522.8022.3497.982.5 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取樣品5份，按上述方法制備樣品溶液和做液相色譜檢測，計(jì)算5個(gè)樣品中虎杖中白藜蘆醇的平均含量為0.3506%，相對誤差RSD為2.56%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3?？梢钥闯?，檢測結(jié)果表現(xiàn)出很好的重復(fù)性，實(shí)驗(yàn)誤差在允許范圍內(nèi)。據(jù)此認(rèn)為可將此法用于實(shí)際樣品分析。表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab. 3 Res

15、ults of repeatability test序 號加入量（g）白藜蘆醇（%）相對誤差（RSD）120.02360.34852.560%220.03250.3548319.98970.3493420.00480.3509520.00420.34952.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)及提取方法的影響2.6.1 對同一供試品溶液在8 h之內(nèi)每隔1 h測定峰面積，試驗(yàn)結(jié)果表明。白藜蘆醇色譜峰面積無明顯變化，其峰面積積分值的相對誤差RSD分別為1.196,表明樣品的溶液穩(wěn)定性很好。2.6.2 由于白藜蘆醇對光熱較敏感易分解，用常規(guī)法提取時(shí)活性受影響，且提取率低，故采用微波提取法。微波提取是近年才發(fā)展起來的一項(xiàng)新

16、技術(shù)，與常規(guī)提取相比，其最大特點(diǎn)是作用時(shí)間短、速度快、提取效率高、提取溫度低(<45)。微波用于虎杖白藜蘆醇的提取，可最大限度地避免提取過程中受光、熱影響而分解，提取率大大提高。本實(shí)驗(yàn)在加熱回流辦法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的基礎(chǔ)上，采用微波提取法來提取白藜蘆醇，來對比其與常規(guī)浸提法對白藜蘆醇提取率的影響。表4為常規(guī)浸提法和微波法對白藜蘆醇的提取對比。可見微波法對白藜蘆醇的提取具有效率和得率高的優(yōu)點(diǎn)。表 4 提取方法對虎杖鮮根莖白藜蘆醇提取率的影響Table 4 Influence of extraction method for resveratrol on yield提取方法提取時(shí)間（min）提取

17、溫度（）提取物中白藜蘆醇含量得 率（%）常規(guī)浸提法60450.3212%80.24微波法5400.3546%96.282.7 結(jié)論2.7.1 虎杖成分極其復(fù)雜12,不經(jīng)預(yù)處理難以獲得理想的分離效果，從而影響白藜蘆醇含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文采用聚酰胺柱子預(yù)處理提取液成功地排除了其它組分的干擾，再進(jìn)行HPLC檢測，獲得較好的分離度，且回收率高，因此本法可用作虎杖中自藜蘆醇含量的分析檢測方法。2.7.2 測定結(jié)果表明，虎杖中自藜蘆醇含量可高達(dá)0.3500%，我國虎杖資源十分豐富，虎杖可作為白藜蘆醇提取的主要原料。2.7.3 乙腈具有較強(qiáng)的毒性，對環(huán)境和試驗(yàn)人員造成一定的傷害。本研究改選用無污染的乙

18、醇-水體系，試驗(yàn)結(jié)果證明，本研究建立的HPLC法，樣品經(jīng)過預(yù)處理，為測定中草藥及其相關(guān)產(chǎn)品中白藜蘆醇提供了可靠的測定方法。該測定方法靈敏度高、重復(fù)性好、簡便實(shí)用，為虎杖和含白藜蘆醇類中成藥的有效成分的質(zhì)量評價(jià)和控制提供了快速分析方法。參考文獻(xiàn):1 yoshlyuki kimuLa,Chohachi Konno,Masayasu Kimura. New constituent of roots of Polygonum cuspidatumJ.Planta Med,l983,48(3):l64-1692 Yoshiyuki Kimura,Sakuji Ko. Effects of stilbene components of roots of Polygonum cuspidatum on liver injury in peroxidized oil-fed ratsJ.Planta Med,1983,48(1):51-54.3 GANINI S J,HIRNTHI J,EUNG S L,et a1.Kinase inhibitors from Polygonum cuspidatumJ. J Nat Prod.,1993,56(10):l805-l810.4 .D.湖南中醫(yī)藥大學(xué),2008.5朱鴻津. HPLC法測定虎杖中白藜蘆醇