細(xì)胞穿膜肽的研究進(jìn)展

1、細(xì)胞穿膜肽的研究進(jìn)展摘 要：細(xì)胞穿膜肽(CPP)是具有穿透多種細(xì)胞膜功能的小分子多肽,能攜帶生物活性大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞。由于CPP 缺乏組織選擇性和靶向性,限制了其在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一些具有細(xì)胞穿透功能的短肽（少于30個(gè)氨基酸）即細(xì)胞穿膜肽（CPPs）,能夠有效地將蛋白質(zhì)、多肽、核酸片段等以多種方式導(dǎo)入多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞,其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且不會(huì)造成細(xì)胞損傷。CPPs的發(fā)現(xiàn)為生物大分子在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床藥效評(píng)價(jià)以及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域等均具有良好的應(yīng)用前景。本文就CPPs的種類特點(diǎn)、內(nèi)化機(jī)制、應(yīng)用及其存在的問(wèn)題進(jìn)行討論和評(píng)述。關(guān)鍵詞：細(xì)胞穿膜肽；靶向性；穿膜機(jī)制

2、1 細(xì)胞穿膜肽的性質(zhì)、分類 到目前為止,已發(fā)現(xiàn)了多種 CPPs, 它們共有的性質(zhì): 具有凈正電荷性和兩親性；穿膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率高; 可以導(dǎo)入近乎所有的細(xì)胞；可以攜帶多種活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞；可以通過(guò)固相合成或原核表達(dá)制備,方法成熟簡(jiǎn)便。 CPPs 的分類以及統(tǒng)一的術(shù)語(yǔ)還沒(méi)有。根據(jù)不同的分類標(biāo)準(zhǔn), 得到不同的種類。 最近有學(xué)者根據(jù)短肽的特點(diǎn)和來(lái)源將其分為3大類:蛋白衍生肽(protein derived CPPs), 如penetratin、TAT和pVEC等； 模型肽(model peptides) 如MAP和(Arg)7等；設(shè)計(jì)肽(designed CPPs)如MPG和Transportan等。從其兩

3、親性性質(zhì)也可將其分為3類: 兩親性CPPs (PaCPPs), 如MPG、 transportan、TP10、Pep-1;中等兩親性CPPs (SaCPPs),如penetratin, RL16；非兩親性 CPPs (NaCPPs),如 R9。2 細(xì)胞穿膜肽的穿膜機(jī)制盡管細(xì)胞穿膜肽已經(jīng)成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，但其穿膜機(jī)制目前仍暫無(wú)定論，且存在很大爭(zhēng)論因此，弄清細(xì)胞穿膜肽的內(nèi)化機(jī)制，是將其作為藥物載體應(yīng)用于臨床研究前需要解決的首要問(wèn)題目前，對(duì)于CPPs 穿膜機(jī)制的描述主要有以下2 種。第一，通過(guò)胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞這方面研究多是通過(guò)熒光標(biāo)記并使用胞吞作用抑制劑的方法，通過(guò)對(duì)比胞吞作用抑制劑使用與否對(duì)

4、CPPs 及其底物入胞作用的影響， 來(lái)評(píng)價(jià)CPPs的入胞機(jī)制。第二， 通過(guò)靜電作用與細(xì)胞膜相結(jié)合并誘導(dǎo)膜脂質(zhì)雙分子層產(chǎn)生短暫的孔隙而直接滲透進(jìn)入細(xì)胞由于目前所研究的細(xì)胞穿膜肽多以陽(yáng)離子 CPPs 為主， 如 HIV Tat， 寡聚精氨酸等因此，有人提出，細(xì)胞穿膜肽的穿膜機(jī)制可能與其電荷特性有關(guān)，而人體組織細(xì)胞表面為負(fù)電荷特性，也為陽(yáng)離子 CPPs 與之吸附及發(fā)生穿透作用提供了理論依據(jù) Herce 等認(rèn)為細(xì)胞穿膜肽的陽(yáng)離子特性不僅使 CPPs有易于與細(xì)胞膜表面的結(jié)合， 還能夠誘導(dǎo)膜雙分子層的失穩(wěn)并產(chǎn)生短暫孔隙 Herce 等進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定脂質(zhì)雙分子層的電子流向證實(shí)了這種假設(shè)， 并認(rèn)為精氨酸殘

5、基在陽(yáng)離子CPPs誘導(dǎo)的穿膜作用中扮演重要角色。3 細(xì)胞穿膜肽的應(yīng)用近年來(lái)，細(xì)胞穿膜肽作為分子載體應(yīng)用于體內(nèi)外入胞轉(zhuǎn)運(yùn)的研究越來(lái)越多 與其他生物大分子轉(zhuǎn)運(yùn)方法相比，細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的入胞作用具有很多優(yōu)勢(shì)首先， 細(xì)胞穿膜肽能夠有效轉(zhuǎn)導(dǎo)具有不同分子量和天然性質(zhì)的大分子進(jìn)入細(xì)胞；其次， 細(xì)胞穿膜肽毒性相對(duì)較?。辉俅?，細(xì)胞穿膜肽的非特異性穿膜作用使其應(yīng)用更廣泛；最后，細(xì)胞穿膜肽不僅可以應(yīng)用于注射給藥，還可以用于鼻黏膜給藥口服給藥細(xì)胞穿膜肽可以運(yùn)輸多種物質(zhì)到哺乳動(dòng)物的的多種細(xì)胞中，包括:小分子核酸，多肽，蛋白，質(zhì)粒DNA，寡聚核苷酸，脂質(zhì)體及其他一些納米藥物載體等。 這些應(yīng)用為疾病診斷和治療提供了一種新方

6、法，大大推進(jìn)了分子生物學(xué)、藥學(xué)、 細(xì)胞生物學(xué)、疫苗學(xué)、甚至影像學(xué)的發(fā)展。近年CPPs的應(yīng)用進(jìn)展如下：3.1 蛋白質(zhì)及多肽類藥物的運(yùn)輸對(duì)許多疾病使用外源蛋白質(zhì)或多肽類藥物是一個(gè)非常有價(jià)值的治療方法。Wu 等利用穿膜肽的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能來(lái)介導(dǎo)信號(hào)肽-綠色熒光蛋白-穿膜肽 NT4-GFP-Ant 融合蛋白通過(guò)細(xì)胞膜和血腦屏障到達(dá)靶細(xì)胞。Tat(Tat4860)能將細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑的細(xì)胞毒素肽模擬物P21EAF1/CIP1運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞核內(nèi),且研究發(fā)現(xiàn)Tat4860P10 可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Zhang 等1根據(jù)一種螺旋肽CAI的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)出了一種細(xì)胞穿膜肽NYAD-1,它比CAI具有更穩(wěn)定的螺旋結(jié)構(gòu),

7、研究發(fā)現(xiàn), NYAD-1能夠穿過(guò)細(xì)胞膜并與Gag聚蛋白共定位于質(zhì)膜上,破壞病毒顆粒的自組裝。研究者2設(shè)計(jì)了一種含有穿膜肽、彈性蛋白類似多肽 ELP (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)和一種衍生于細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑P21 的結(jié)合多肽,這種多肽能夠使 SKOV-3 卵巢癌細(xì)胞和HeLa子宮癌細(xì)胞的生長(zhǎng)速率減慢而抑制它們的增殖。HIV-Tat 與小泰勒蟲抗原 Tp2 結(jié)合形成重組Tat-Tp2 融合蛋白,發(fā)現(xiàn)其能夠加強(qiáng)遲鈍的 CD8+T細(xì)胞反應(yīng)的興奮性。3.2 核酸類藥物的運(yùn)輸核酸類藥物的細(xì)胞運(yùn)輸具有挑戰(zhàn)性。最近有關(guān)使用CPPs 進(jìn)行核酸細(xì)胞運(yùn)輸?shù)睦虞^多。研究證明, 細(xì)胞膜穿透性寡

8、肽八聚精氨酸(R8)修飾的脂質(zhì)體可以有效輸送 siRNA 進(jìn)入細(xì)胞并增強(qiáng)其生物學(xué)功能。Palm-Apergi等3研究一種細(xì)胞穿膜肽 MAP,用這種典型的抗菌肽處理細(xì)菌產(chǎn)生細(xì)菌空殼,這種空可以載入所需的 DNA 或質(zhì)粒并將其運(yùn)輸進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi),還可以用于預(yù)防接種。Meade 等4研究認(rèn)為, CPPs 為雙鏈 siRNA 進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)化去誘導(dǎo) RNAi 反應(yīng)提供了一種好方法。Veldhoen 等34研究發(fā)現(xiàn)一種新的載體肽 MPG能同時(shí)與核酸形成非共價(jià)連接的、具有高靈活性的復(fù)合物,它可以作為運(yùn)輸 siRNA 的載體。與轉(zhuǎn)座子結(jié)合的“睡美人”轉(zhuǎn)座酶能將特殊基因轉(zhuǎn)移進(jìn)目標(biāo)動(dòng)物體內(nèi)。 這些特殊基因有助于

9、治療多種疾病。有研究5發(fā)現(xiàn)細(xì)胞穿膜肽 M918 可以完成“睡美人”轉(zhuǎn)座酶和一個(gè)外源轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒 (帶有一種抗生素基因)在體外的細(xì)胞內(nèi)共轉(zhuǎn)導(dǎo)運(yùn)輸。具有空間位阻的帶電荷中性寡核苷酸類似物, 如肽核酸 (PNA)和磷酰二胺嗎啉代寡核苷酸(PMO),在反義引物的應(yīng)用方面具有很好的生物學(xué)和藥理學(xué)性質(zhì)。 然而,寡聚核酸在細(xì)胞內(nèi)不能自由運(yùn)輸,因此, Lebleu 等6研究了兩種富含精氨酸的 CPPs(R-Ahx-R)4AhxB (R =精氨酸, Ahx = 胺己苯酸酯, B =-丙氨酸)和 R6Pen,它們能夠在胞內(nèi)體溶解劑存在的情況下, 在低摩爾濃度下將PNA和PMO進(jìn)行有效的核運(yùn)輸。研究發(fā)現(xiàn),固相合成穿膜

10、肽 Tat 能夠攜帶質(zhì)粒 DNA 穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染,并對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響7。3.3 小分子藥物運(yùn)輸研究表明,富含精氨酸的細(xì)胞穿膜肽可以直接運(yùn)輸磷酸二酰胺嗎啉齊聚物進(jìn)入鼠類白細(xì)胞,抑制其基因表達(dá)和改變前體mRNA的剪接8。Lindgren 等43設(shè)計(jì)了一種 CPP 與細(xì)胞抑制劑甲氨蝶呤 (MTX) 的結(jié)合物, 用于克服乳腺癌腫瘤細(xì)胞對(duì)甲氨蝶呤的耐受。將 2', 5'-寡腺甙酸四聚物(2-5A)與短鏈 HIV-1Tat 肽用化學(xué)方法結(jié)合產(chǎn)生2-5A-Tat 嵌合體9,此嵌合體可以被細(xì)胞吸收并能在完整的細(xì)胞中活化核糖核酸酶L, 它可能為HIV的RNA 在體內(nèi)的靶向破壞提供了一

11、種方法。3.3 增強(qiáng)藥物的吸收及其他特殊功能 Kamei 等10發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用 CPPs 可以促進(jìn)胰島素的腸內(nèi)吸收。Khafagy 等11研究發(fā)現(xiàn) L-型穿膜肽 penetratin 可以顯著增加胰島素的滲透性而使其穿過(guò)鼻膜, 并對(duì)鼻吸收黏膜上的細(xì)胞完整性不會(huì)引起明顯的破壞。 Tunnemann 等12研究認(rèn)為細(xì)胞穿膜肽介導(dǎo)的肽轉(zhuǎn)導(dǎo)作用不僅是一種對(duì)細(xì)胞內(nèi) Ca2+無(wú)副作用情況下可以增加心肌功能的唯一方法, 而且是一般細(xì)胞或干細(xì)胞中蛋白質(zhì)之間相互作用的調(diào)節(jié)和控制的非常有用的工具。Kloss 等13研究發(fā)現(xiàn),含有410 個(gè)精氨酸殘基的寡聚精氨酸, 特別是 (Arg)8 能夠抑制細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白水解系

12、統(tǒng)。 當(dāng)考慮寡聚精氨酸作為藥物的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸載體時(shí),必須考慮其對(duì)蛋白酶的制活性問(wèn)題。有研究報(bào)道, 成功設(shè)計(jì)的一種新的穿膜肽Pep-1-K (衍生于穿膜肽Pep-1) 具有強(qiáng)的抗菌活性, 可以作為細(xì)菌選擇性抗菌肽14。Johansson 等50研究發(fā)現(xiàn)了一種含有 22 個(gè)氨基酸殘基的衍生于腫瘤抑制基因P14ARF的N端部分的肽ARF (1-22), 它是一種具有 P14ARF 功能的類似物,對(duì)細(xì)胞膜有穿透性, 膜破壞性低且能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以前研究認(rèn)為大多數(shù)CPPs 可以易位穿過(guò)哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)膜, 而不能穿過(guò)像酵母細(xì)胞的細(xì)胞膜。然而, Parenteau 等15對(duì) 20 種CPPs進(jìn)行了測(cè)試, 發(fā)現(xiàn)

13、有一種肽Tp10能有效的穿過(guò)裂殖酵母細(xì)胞并在細(xì)胞內(nèi)均勻分布。 由于治療分子不能穿過(guò)質(zhì)膜, 基因和藥物運(yùn)輸進(jìn)入眼部組織,例如視網(wǎng)膜和角膜被阻礙, Johnson 等16研究發(fā)現(xiàn)了一種能用于眼部組織運(yùn)輸?shù)男码?POD, 能夠運(yùn)輸小分子和大分子藥物進(jìn)入神經(jīng)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和角膜細(xì)胞等。如果能夠通過(guò)高分辨率成像技術(shù)追蹤干細(xì)胞的分布和分化的能力,對(duì)臨床和研究非常重要。Liu等17用一種典型的 CPP 承載釓顆粒,此顆?？梢杂糜诠撬栝g質(zhì)干細(xì)胞的磁共振成像。 熒光成像技術(shù)確定此復(fù)合物可以內(nèi)化進(jìn)入干細(xì)胞質(zhì)和核內(nèi), 毒性實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞儀分析表示此復(fù)合物不會(huì)影響細(xì)胞的生存和膜電勢(shì)梯度。關(guān)于 CPPs 的氨基酸序

14、列見(jiàn)表 1。 表1 CPPs 的氨基酸序列4 細(xì)胞穿膜肽在應(yīng)用中的不足CPP 缺乏組織選擇性和腫瘤靶向性,單純憑借CPP 無(wú)法使抗腫瘤藥物定向積,使作用于腫瘤部位的藥物濃度減少,對(duì)正常組織的損傷性增大。同時(shí) CPP 的正電性易與血漿中荷負(fù)電的成分發(fā)生相互作用,從而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)快速清除, 導(dǎo)致 CPP在體內(nèi)不穩(wěn)定,極大地限制了其在腫瘤治療中的應(yīng)用18。因此,提高 CPP 的腫瘤靶向性是將其應(yīng)用于腫瘤治療領(lǐng)域的關(guān)鍵。CPPs 在藥物運(yùn)輸過(guò)程中的使用存在的另外一個(gè)弊端是其穩(wěn)定性差。CPPs 內(nèi)化后, 由于體內(nèi)含有各種蛋白酶, 它可能會(huì)酶解外源 CPPs 及其藥物分子；體內(nèi)的環(huán)境包括 pH 值、離子

15、濃度等都有可能改變CPPs 的某些性質(zhì)使其失去活性。因此, 必須通過(guò)尋找新的穩(wěn)定的 CPPs58或?qū)ΜF(xiàn)有的 CPPs 進(jìn)行修飾改進(jìn)來(lái)解決這方面的問(wèn)題。 一些蛋白在內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞后不再具有生物活性,可以考慮在蛋白和 CPPs 之間插入一個(gè)連接分子來(lái)輔助在細(xì)胞內(nèi)釋放有活性的蛋白和藥物。此外, CPPs 是否有免疫原性或半免疫原性及長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生何種影響, 需要將 CPPs 序列進(jìn)一步的優(yōu)化以提高其適用性19。一些證據(jù)顯示, CPPs可以與任意的分子結(jié)合,非靶向性進(jìn)入細(xì)胞內(nèi), 導(dǎo)致生物活性藥物不必要的損失。因此,如果不能建立可行性使用方法以促進(jìn)細(xì)胞特異性運(yùn)輸,將限制細(xì)胞穿膜肽在機(jī)體內(nèi)運(yùn)輸藥物等方

16、面的應(yīng)用。目前,在能夠有效利用 CPPs 運(yùn)輸藥物以充分發(fā)揮治療作用方面有價(jià)值的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果還鮮見(jiàn)報(bào)道。這種載藥方式在應(yīng)用中是否存在潛在的細(xì)胞毒性以及運(yùn)輸過(guò)程中缺乏細(xì)胞特異性等問(wèn)題尚未引起足夠的的重視20。一些 CPPs 存在細(xì)胞內(nèi)化差,出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)代謝性降解及一些不良的生物效應(yīng)如毒性和免疫原性等。需要進(jìn)一步開(kāi)展對(duì) CPPs 的藥代動(dòng)力學(xué)、體內(nèi)分布等相關(guān)研究。5 展望 CPPs 的發(fā)現(xiàn)為生物大分子用于疾病治療帶來(lái)了曙光, 在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、評(píng)價(jià)及細(xì)胞免疫學(xué)等研究領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用前景。隨著研究深入，越來(lái)越多的 CPPs 及其類似物將被發(fā)現(xiàn)和構(gòu)建，而作為研究基礎(chǔ)的對(duì) CPPs

17、 的基本序列及穿膜機(jī)制的探討尤顯重要，特別是新的研究方法和研究手段的建立與驗(yàn)證ACPPs 作為一種新型載體應(yīng)用于靶向制劑，能夠顯著提高藥物的生物利用度，將逐漸成為 CPPs 領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)筆者認(rèn)為， 隨著研究的深入， 構(gòu)建能夠被病變部位或細(xì)胞特異性識(shí)別并打開(kāi)的連接鍵，或進(jìn)一步提高 CPPs 融合多肽對(duì)靶組織微環(huán)境的敏感性。參考文獻(xiàn)：1 ZARO J L, SHEN W C. Quantitative comparison of membrane transduction and endocytosis of oligopeptidesJ. Biochem Biophy Res Comm, 20

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