種子的擴大培養(yǎng)

1、關(guān)于種子的擴大培養(yǎng)第一頁，共48頁幻燈片指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的菌種接入指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng)養(yǎng), ,最終獲得一定發(fā)酵產(chǎn)量高、數(shù)量充足、無污染的生產(chǎn)菌最終獲得一定發(fā)酵產(chǎn)量高、數(shù)量充足、無污染的生產(chǎn)菌種的過程。種的過程。第一節(jié)第一節(jié) 種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子擴大培養(yǎng)的目的與要求種子擴大培養(yǎng)種子擴大培養(yǎng)第二頁，共48頁幻燈片種子擴培的目的種子擴培的目的q 接種量的需要接種量的需要q 菌種的馴化菌種的馴化q 縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平縮短發(fā)酵時間、保

2、證生產(chǎn)水平第三頁，共48頁幻燈片 細(xì)胞生長活力強，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短； 生理性狀穩(wěn)定； 菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求； 無雜菌污染； 保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。 第四頁，共48頁幻燈片第五頁，共48頁幻燈片第六頁，共48頁幻燈片實驗室階段實驗室階段：所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實驗室常見設(shè)備，在工廠中培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成。見設(shè)備，在工廠中培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成。生產(chǎn)車間階段生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在種子培養(yǎng)在種子罐里面進行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理。工程歸為發(fā)酵車間管理。第七頁，共48頁幻燈片第八頁，共48頁幻

3、燈片 一般采用兩種方式： 對于產(chǎn)孢子能力強及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子。 對于產(chǎn)孢子能力不強或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法，獲得菌絲體，作為種子。 第九頁，共48頁幻燈片、斜面、斜面 (AS1.299)(AS1.299)培養(yǎng)基：蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨 1%1%，牛肉膏，牛肉膏1%1%，氯化鈉，氯化鈉 0.50.5 瓊脂瓊脂 2%2%， pH 7.0-7.2pH 7.0-7.2培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細(xì)培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，原料比較精細(xì)培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：3232，生長，生長18-2418-24小時小時q 對于不產(chǎn)

4、孢子和孢子發(fā)芽慢的微生物對于不產(chǎn)孢子和孢子發(fā)芽慢的微生物獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，如谷氨酸的種子培養(yǎng)。培養(yǎng)。第十頁，共48頁幻燈片. . 一級種子（搖瓶）一級種子（搖瓶）培養(yǎng)條件：于培養(yǎng)條件：于1000ml1000ml三角瓶中，裝液三角瓶中，裝液200-250ml,32200-250ml,32培培養(yǎng)養(yǎng)1212小時。小時。培養(yǎng)基：葡萄糖培養(yǎng)基：葡萄糖2%2%，尿素，尿素0.5%0.5%，玉米漿，玉米漿 2.5%2.5%， K K2 2HPOHPO4 4 0.1% 0.1%培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的原料已經(jīng)基培養(yǎng)基特點：有利于菌體的生長，所使用的

5、原料已經(jīng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基q 對于不產(chǎn)孢子和孢子發(fā)芽慢的微生物對于不產(chǎn)孢子和孢子發(fā)芽慢的微生物第十一頁，共48頁幻燈片. .二級種子二級種子( (種子罐種子罐) )培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件：在種子罐中培養(yǎng)（容積為發(fā)酵罐的1%(10%)1%(10%)），），3232培養(yǎng)培養(yǎng)7-107-10個小時個小時培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代培養(yǎng)基：和一級種子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，濃度為替，濃度為2.5%2.5%培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)基的特點：長菌體，更接近于發(fā)酵培養(yǎng)基第十二頁，共48頁幻燈片種子的質(zhì)量要求：種子的質(zhì)量要

6、求：10108 8-10-109 9個個/ml/ml大小均勻，呈單個或八字排列大小均勻，呈單個或八字排列PH 7.0-7.2PH 7.0-7.2時結(jié)束，時結(jié)束，6.887.0-7.26.887.0-7.2活力旺盛活力旺盛第十三頁，共48頁幻燈片 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的孢子 與菌絲體培養(yǎng)相比步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)與菌絲體培養(yǎng)相比步驟少，因而更容易獲得量和質(zhì)穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。穩(wěn)定的種子，但操作繁瑣。q 對于產(chǎn)孢子的微生物對于產(chǎn)孢子的微生物 獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌絲體便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。便于操作，但需要更仔細(xì)的控制。第十四頁，共4

7、8頁幻燈片2 2、培養(yǎng)基選擇的原則、培養(yǎng)基選擇的原則 有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的有利于菌體的生長，對孢子培養(yǎng)基應(yīng)該是有利于孢子的生長。生長。 在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較在原料方面，實驗室種子培養(yǎng)階段，規(guī)模一般比較小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都小，因此為了保證培養(yǎng)基的質(zhì)量，培養(yǎng)基的原料一般都比較精細(xì)。比較精細(xì)。第十五頁，共48頁幻燈片 種子罐的培養(yǎng)基成分原則為采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米漿、磷酸鹽等，如果是需氧菌，同時還需供給足夠的無菌空氣，并不斷攪拌，使菌（絲）體在培養(yǎng)液中均勻分布，獲得相同的培養(yǎng)條件。 第十六頁，共48頁幻燈片1

8、 1、培養(yǎng)物的選擇原則、培養(yǎng)物的選擇原則在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。在生產(chǎn)車間階段，最終一般都是獲得一定數(shù)量的菌絲體。q 縮短發(fā)酵時間縮短發(fā)酵時間q 有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果有利于獲得好的發(fā)酵結(jié)果菌絲體比孢子要有利菌絲體比孢子要有利：第十七頁，共48頁幻燈片2 2、培養(yǎng)基選擇的原則、培養(yǎng)基選擇的原則目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，培養(yǎng)基首先考慮有利目的：獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的菌體，培養(yǎng)基首先考慮有利于孢子的發(fā)育和菌體的生長，營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基于孢子的發(fā)育和菌體的生長，營養(yǎng)要比發(fā)酵培養(yǎng)基豐富。豐富。在原料方面：不如實驗室階段那么精細(xì)，基本接近于發(fā)在原料方面：不如實驗室階段那么精

9、細(xì)，基本接近于發(fā)酵培養(yǎng)基酵培養(yǎng)基: : 一是成本一是成本 二是馴化二是馴化第十八頁，共48頁幻燈片例：檸檬酸發(fā)酵例：檸檬酸發(fā)酵q 以蔗糖為原料以蔗糖為原料成分成分 斜面斜面 種子罐種子罐 發(fā)酵發(fā)酵麥芽汁麥芽汁 麥汁麥汁 蔗糖蔗糖 2.5-5% 20%2.5-5% 20%NHNH4 4NONO3 3 0.225% 0.11%0.225% 0.11%K K2 2HPOHPO4 4 0.03% 0.03% MgSOMgSO4 4.H.H2 2O 0.025% 0.025% O 0.025% 0.025% KCl 0.015%KCl 0.015%瓊脂瓊脂 2%2%第十九頁，共48頁幻燈片 使孢子發(fā)芽，

10、生長繁殖成菌（絲）體，接入發(fā)酵罐能迅速生長，達(dá)到一定的菌體量，以利于產(chǎn)物的合成。第二十頁，共48頁幻燈片 種子罐級數(shù)：指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，取決于： 菌種生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度； 所采用發(fā)酵罐的容積 4、種子罐級數(shù)的確定、種子罐級數(shù)的確定 第二十一頁，共48頁幻燈片谷氨酸：三級發(fā)酵谷氨酸：三級發(fā)酵一級種子（搖瓶）一級種子（搖瓶）二級種子二級種子 （小罐）（小罐）發(fā)酵發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵青霉素：三級發(fā)酵一級種子一級種子 （小罐）（小罐）二級種子（中罐）二級種子（中罐）發(fā)酵發(fā)酵 一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時工一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時工廠從第一級種子罐

11、開始計算發(fā)酵級數(shù)廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)第二十二頁，共48頁幻燈片發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)發(fā)酵級數(shù)確定的依據(jù)q 級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響級數(shù)受發(fā)酵規(guī)模、菌體生長特性、接種量的影響q 級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般2-42-4級。級。q 在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級數(shù)的確定是非常重要的在發(fā)酵產(chǎn)品的放大中，反應(yīng)級數(shù)的確定是非常重要的一個方面一個方面第二十三頁，共48頁幻燈片 細(xì)菌：生長快，種子用量比例少，級數(shù)也較少，二級發(fā)酵。 茄子瓶種子罐發(fā)酵罐 霉菌：生長較慢，如青霉菌，三級發(fā)酵 孢子懸浮液一級種子罐（27C,40小

12、時孢子發(fā)芽，產(chǎn)生菌絲 ）二級種子罐（ 27C,1024小時，菌體迅速繁殖，粗壯菌絲體）發(fā)酵罐 放線菌：生長更慢，采用四級發(fā)酵 酵母：比細(xì)菌慢，比霉菌，放線菌快，通常用一級種子 第二十四頁，共48頁幻燈片 種子級數(shù)越少越好，可簡化工藝和控制，減少染菌機會 種子級數(shù)太少，接種量小，發(fā)酵時間延長，降低發(fā)酵罐的生產(chǎn)率，增加染菌機會 雖然種子罐級數(shù)隨產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模而定。但也與所選用工藝條件有關(guān)。如改變種子罐的培養(yǎng)條件，加速了孢子發(fā)芽及菌體的繁殖，也可相應(yīng)地減少種子罐的級數(shù)。 n確定種子罐級數(shù)需注意的問題確定種子罐級數(shù)需注意的問題第二十五頁，共48頁幻燈片5 5、接種量的確定、接種量的確定 移入種子

13、的體積移入種子的體積接種量接種量 接種后培養(yǎng)液的體積接種后培養(yǎng)液的體積接種量過多，菌絲生長過快、溶氧不足，衰老細(xì)胞增加接種量過多，菌絲生長過快、溶氧不足，衰老細(xì)胞增加等，發(fā)酵后勁不足等，發(fā)酵后勁不足種量過少延長發(fā)酵周期，形成異常形態(tài)，而且易造成種量過少延長發(fā)酵周期，形成異常形態(tài)，而且易造成染菌。染菌。 以生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度為依據(jù)以生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度為依據(jù)接種量的大小直接影響發(fā)酵周期。接種量的大小直接影響發(fā)酵周期。第二十六頁，共48頁幻燈片雙種：兩個種子罐接種到一個發(fā)酵罐中。倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)倒種：一部分種子來源于種子罐，一部分來源于發(fā)酵罐。酵罐。

14、過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素過大過小都不好，最終以實踐定，如大多數(shù)抗生素為為7-15%7-15%。但是一般認(rèn)為大一點好。但是一般認(rèn)為大一點好。第二十七頁，共48頁幻燈片采用被孢霉進行采用被孢霉進行亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體接種量對菌體形態(tài)和產(chǎn)接種量對菌體形態(tài)和產(chǎn)亞麻酸的影響亞麻酸的影響 楊博，楊博， 中國油脂，中國油脂，20022002第二十八頁，共48頁幻燈片研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進行研究發(fā)現(xiàn)，采用被孢霉進行亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲亞麻酸發(fā)酵時接種量可以明顯影響菌絲體的形態(tài)，從而影響菌體干重和體的形態(tài)，從而影響菌體干重和亞

15、麻酸產(chǎn)量。亞麻酸產(chǎn)量。第二十九頁，共48頁幻燈片 不同接種量影響菌體的生長和發(fā)酵不同接種量影響菌體的生長和發(fā)酵第三十頁，共48頁幻燈片發(fā)酵前期發(fā)酵液作為種子，發(fā)酵指數(shù)明顯提高發(fā)酵前期發(fā)酵液作為種子，發(fā)酵指數(shù)明顯提高發(fā)酵后期菌體自溶明顯，影響提煉收率發(fā)酵后期菌體自溶明顯，影響提煉收率第三十一頁，共48頁幻燈片20%20%種子罐種子罐10%10%發(fā)酵罐前期發(fā)酵液效果最好發(fā)酵罐前期發(fā)酵液效果最好第三十二頁，共48頁幻燈片6 6、種齡、種齡指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時指種子罐中培養(yǎng)的菌體開始移入下一級種子罐或發(fā)酵罐時的培養(yǎng)時間。的培養(yǎng)時間。種齡短：菌體太少；種齡長：易老化種齡短：

16、菌體太少；種齡長：易老化。原則：對數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強，菌體濃度相對原則：對數(shù)生長期末，細(xì)胞活力強，菌體濃度相對較大，但是最終由實驗結(jié)果定。較大，但是最終由實驗結(jié)果定。第三十三頁，共48頁幻燈片v大量地接入培養(yǎng)成熟的菌種的優(yōu)點：縮短生長過程的延緩期，因而縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率節(jié)約發(fā)酵培養(yǎng)的動力消耗有利于減少染菌機會第三十四頁，共48頁幻燈片舒琴，舒琴， 林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，20042004鏡檢：鏡檢：2424小時多個桿菌首位相連成線形，處于繁殖旺盛期小時多個桿菌首位相連成線形，處于繁殖旺盛期 3030小時開始出現(xiàn)芽孢小時開始出現(xiàn)芽孢第三十五頁，共48頁幻燈片v原材料質(zhì)量

17、v培養(yǎng)溫度v濕度v通氣與攪拌v 斜面冷藏時間斜面冷藏時間v 培養(yǎng)基培養(yǎng)基v pHpH第三十六頁，共48頁幻燈片v 原材料質(zhì)量波動引起種子質(zhì)量不穩(wěn)定v 原材料質(zhì)量波動的主要原因：無機離子含量不同（微量元素MgMg2+2+、CuCu2+2+、BaBa2+2+能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少也會影響孢子的質(zhì)量）。 第三十七頁，共48頁幻燈片v 溫度過低，菌種生長發(fā)育緩慢v 溫度過高會使菌絲過早自溶在制備土霉素生產(chǎn)種子過程中，高于在制備土霉素生產(chǎn)種子過程中，高于3737培養(yǎng)時，培養(yǎng)時，孢子接入發(fā)酵罐后表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨基氮回升孢子接入發(fā)酵罐后表現(xiàn)出糖代謝變慢，氨基氮回升提前，菌絲過早自溶，效價降低

18、等現(xiàn)象。提前，菌絲過早自溶，效價降低等現(xiàn)象。第三十八頁，共48頁幻燈片v濕度低，孢子生長快；v濕度大，孢子生長慢 制備土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子時制備土霉素生產(chǎn)菌種龜裂鏈霉菌孢子時發(fā)現(xiàn)，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下發(fā)現(xiàn)，在含有少量水分的試管斜面培養(yǎng)基下部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速部孢子長得較好，而斜面上部由于水分迅速蒸發(fā)呈干癟狀，孢子稀少蒸發(fā)呈干癟狀，孢子稀少第三十九頁，共48頁幻燈片v足夠的通氣量，以保證菌種代謝正常，提高種子的質(zhì)量 v攪拌可提高通氣效果，促進生長繁殖，過度攪拌導(dǎo)致培養(yǎng)液大量涌泡，液膜表面的酶易氧化變性，泡沫過多增加染菌機會，增加能耗。v絲狀微生物不宜劇烈攪拌

19、。第四十頁，共48頁幻燈片v對孢子的生產(chǎn)能力有較大影響 v冷藏時間越長，生產(chǎn)能力下降越多 鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在鏈霉素生產(chǎn)中，斜面孢子在66冷藏兩冷藏兩個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月的降低個月后的發(fā)酵單位比冷藏一個月的降低1818，比冷藏比冷藏3 3個月的降低個月的降低3535。 第四十一頁，共48頁幻燈片v培養(yǎng)種子的目的：擴大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)量；同時也必須培養(yǎng)出強壯、健康、活性高的細(xì)胞。為了使細(xì)胞迅速進行分裂或菌絲快速生長。第四十二頁，共48頁幻燈片v 有較完全和豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，糖分少，需充足氮源和生長因子，無機氮源比例大； 各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度不必太高； 供孢子用的種子培養(yǎng)基，可添加易被吸收利用的碳源和氮源； 應(yīng)考慮與發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成