木質(zhì)素降解菌的篩選及混合菌發(fā)酵降解秸稈的研究_圖文

1、中國生物工程雜志 Ch i n a B iotechnology , 2008, 28(2:6670木質(zhì)素降解菌的篩選及混合菌發(fā)酵降解秸稈的研究*黃 茜1, 2黃鳳洪2*江木蘭2 萬楚筠2 劉 睿2(1華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 武漢 430070 2中國農(nóng)科院油料作物研究所 武漢 430062摘要 農(nóng)作物秸稈是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的副產(chǎn)品, 也是一項重要的生物資源。其成分結(jié)構(gòu)的特殊性所導致的難降解問題, 一直是轉(zhuǎn)化利用秸稈的難題。利用混合菌將秸稈纖維素轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)、乙醇、乙酸、乳酸等研究是目前熱點。通過馬鈴薯瓊脂平板培養(yǎng)、馬鈴薯液體搖瓶培養(yǎng)和稻草秸稈固態(tài)發(fā)酵, 從6株常見的食用白腐菌中篩選出了生長優(yōu)勢較強

2、、產(chǎn)漆酶酶活高的平菇HF 。為了讓秸稈得到更好的降解和利用, 采用平菇和康氏木霉二步混合發(fā)酵法; 通過不同的組合方式, 發(fā)現(xiàn)H 6-T 10組合得出的降解效果最好, 其木質(zhì)素降解率達到44. 77%, 纖維素降解率達到41. 48%。關(guān)鍵詞 秸稈降解 混合發(fā)酵 白腐真菌 木質(zhì)素 纖維素中圖分類號 Q819收稿日期:2007-11-21 修回日期:2007-12-19*武漢市科技攻關(guān)資助項目(20062002063 *通訊作者, 電子信箱:huangf h oil crops . cn農(nóng)作物秸稈作為一種可再生資源, 在我國具有分布廣、數(shù)量大、種類多、價格低廉的特點。如何充分利用這些資源而又使環(huán)境

3、不受污染, 是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)面臨的難題1。農(nóng)作物秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大組分組成, 由于纖維素特別是木質(zhì)素難以被分解, 影響其利用推廣。近幾十年來, 國內(nèi)外科研人員雖然研究了一些物理、化學的秸稈利用方法, 但都存在著利用不充分、成本高等問題24。實踐表明, 秸稈的生物法利用是最佳途徑, 此法具有降解率高, 安全環(huán)保, 成本低等優(yōu)點。自然界中存在許多微生物可以腐蝕和分解秸稈、樹葉及樹木等高纖維物質(zhì), 這些微生物包括細菌、霉菌、酵母菌及食用菌等5。因為秸稈中纖維素含量最高, 所以人們一開始是利用纖維素降解菌 主要是木霉來進行纖維素的降解。但是在對秸稈結(jié)構(gòu)進行研究以后, 人們發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素與半纖

4、維素以共價鍵形式結(jié)合, 將纖維素分子包埋在其中, 形成一種天然屏障, 使纖維素酶等不易與纖維素分子接觸, 而木質(zhì)素的非水溶性、化學結(jié)構(gòu)的復雜性, 導致了秸稈的難降解性6。因此要徹底降解纖維素, 首先必須解決木質(zhì)素的降解問題, 而對木質(zhì)素能進行最有效降解的微生物是白腐真菌(white -rot f ungi7。白腐真菌依賴一系列酶催化反應實現(xiàn)對難降解有機物的轉(zhuǎn)化, 這一過程尤為復雜, 其中的關(guān)鍵酶系為木質(zhì)素降解酶系。木質(zhì)素降解酶系主要包括三部份:木質(zhì)素過氧化物酶(li gni n peroxidase , L i P 、錳過氧化物酶(manganese -de pe ndent peroxida

5、se , M nP 以及漆酶(laccase8。對6株木質(zhì)素降解菌白腐真菌進行了篩選, 并探索了其與纖維素降解菌康氏木霉(T richo der ma koningii 協(xié)同發(fā)酵降解秸稈的組合方式; 通過對這2種真菌混合發(fā)酵降解秸稈的纖維素、木質(zhì)素和半纖維素的研究, 以期為秸稈的綜合利用提供理論與數(shù)據(jù)參考。1 材料與方法1. 1 試驗材料康氏木霉(Trichoder ma koningii 3. 2774, 由中科院微生物研究所提供; 6株白腐真菌:平菇(Pteurorus ostreatusH F 、平菇S N 、黑木耳(Auriculariaauricular 、雙孢蘑菇(Agaricus

6、bis porus 、香菇(Lentinula edodes 和榆黃磨(Pleurotus citrino p ileatus , 均由本實驗室提供。 稻草秸桿, 來自武漢市蔡甸區(qū), 經(jīng)測定其纖維素、半纖維素以及木質(zhì)素含量分別為:34. 62%、21. 39%和9. %。2008, 28(2黃 茜等:木質(zhì)素降解菌的篩選及混合菌發(fā)酵降解秸稈的研究1. 2 培養(yǎng)基馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA :馬鈴薯(質(zhì)量分數(shù), 以下同 20%, 蔗糖2%, 瓊脂2%。馬鈴薯液體培養(yǎng)基:土豆20%,蔗糖2%, 滅菌后分裝入250m l 三角瓶中, 裝液量為50m l 。固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基:稻草秸稈(40目 5. 0g ,

7、 合成培養(yǎng)液912m l 。1. 3 試驗設計 1. 3. 1 白腐菌的篩選 通過6種白腐真菌的菌絲生長速度快慢、生物量大小和產(chǎn)酶酶活高低3個方面的比較, 篩選出生長優(yōu)勢強、產(chǎn)木質(zhì)素降解酶酶活高的優(yōu)勢菌株。 PDA 平板培養(yǎng):將白腐真菌點接到P DA 平板中心, 每24h 觀察菌絲的生長狀況, 并測量其菌落直徑。搖瓶液體培養(yǎng):用打孔器取直徑為8mm 的白腐菌菌絲瓊脂塊3塊, 接種到土豆液體搖瓶中, 28e , 150r/min , 培養(yǎng)21天。每3天取一次菌液, 過濾, 濾渣于100e 烘干后稱重, 得液體培養(yǎng)的生物量; 濾液(粗酶液 用來測定漆酶酶活。秸稈固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng):將經(jīng)5天搖瓶培養(yǎng)的種子

8、液, 以10%的接種量接種到固態(tài)發(fā)酵基上。28e , 靜置培養(yǎng)20天。終止發(fā)酵后, 取發(fā)酵物5. 0g , 用50m l p H =4. 8的醋酸-醋酸鈉緩沖液浸提3h , 過濾, 濾液(粗酶液 用來測漆酶酶活。1. 3. 2 秸稈降解菌的搭配及混合發(fā)酵 (1 菌株兼容性試驗將由上組試驗篩選出的白腐真菌與康氏木霉點接入同一PDA 平板上, 28e 靜置培養(yǎng)5天, 觀察其生長情況, 比較同一平板上兩菌種的生長優(yōu)勢, 以便進行下一步混合發(fā)酵試驗。(2 秸桿降解菌的混合發(fā)酵試驗基于上步菌株兼容性試驗的結(jié)果, 在固態(tài)發(fā)酵基中, 先接種生長優(yōu)勢較弱的菌株(白腐真菌 , 在其分別生長3, 6, 9, 12

9、天后, 再接種生長旺盛的菌株(康氏木霉 , 其培養(yǎng)時間分別是6, 8, 10天。具體組合如表1所示。發(fā)酵完后, 測定發(fā)酵物的纖維素、木質(zhì)素含量。表1 平菇HF 和康氏木霉的組合發(fā)酵方式Tab le 1 The co mb inati on m ode of P teurorus ostrea t u sH F and Trichoder m a kon i ngii康氏木霉培養(yǎng)天數(shù)/d平菇HF 培養(yǎng)天數(shù)/d369126H 3-T6H6-T6H 9-T6H 12-T68H 3-T8H6-T8H 9-T8H 12-T810H 3-T10H 6-T10H9-T10H 12-T10Note :H re

10、presen ts P te uroru s ostre a t u s HF , and T represents T ric hod er ma koning ii . TheH 3-T6comb i nati on group m eans that after cu lti vati on of P te u rorus ost re a t u s H F for 3days , t he soli d s ubs trat e w as i nocu l ate by T richoder m a kon i ng ii . The m i xed fer m en tati on

11、 ti m e w as 6days . The other group are si m ilar1. 4 測定方法1. 4. 1 漆酶(laccase 酶活測定10取粗酶液0. 1m , l加入HA c -N a A c (p H4. 5 緩沖液2. 5m , l 混勻, 加入1mmol /L2, 2c -連氮基-雙(3-乙基苯丙噻唑啉-6磺酸 (ABTS 0. 4m , l 反應在25e 下進行, 放置30s , 每15s 讀取一次吸光值, 測定3m in 內(nèi)反應液在420nm 處OD 值的增加。一個酶活力單位(U 定義為在25e , p H5. 0條件下1m l 酶液每分鐘氧化底物AB

12、TS 引起吸光值的增加量。1. 4. 2 木質(zhì)素、纖維素含量的測定 參照王玉萬系統(tǒng)分析法11。2 結(jié)果與討論2. 1 白腐菌的篩選21111 平板試驗 6株白腐菌均為白色氣生菌絲, 且生長狀況良好。從圖1中可以看到, 其中平菇SN 、平菇HF 以及雙孢蘑菇生長較旺盛, 在8天以內(nèi)白色菌絲都長滿了平板, 說明它們都有較強的生長優(yōu)勢。圖1 各菌株菌絲生長曲線圖F i g . 1 The m yce lia grow th curve of each fungus21112 液體搖瓶培養(yǎng) 在土豆液體搖瓶培養(yǎng)過程中, 這6株白腐菌形成多個白色光滑的菌絲球。由圖2所示, 在21天土豆液體培養(yǎng)過程中, 各

13、菌株生物量的變化曲線基本一致, 即開始隨天數(shù)的增加, 其生物量逐漸增加; 在一定天數(shù)后, 其生物量增加變緩, 有些菌株生物量開始減少, 出現(xiàn)這種情況的原因是隨著天數(shù)的增加, 液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分消耗殆盡, 或是菌株出現(xiàn)了自溶現(xiàn)象等。另外可以看到, 平菇S N 、平菇HF 、榆黃蘑相較其它菌株, 液體培養(yǎng)得到的生物量較多。 在整個搖瓶培養(yǎng)期間, 菌株分泌的漆酶酶活變化規(guī)律如圖3所示?？梢钥吹? 各菌株的變化規(guī)律基本一致, 隨著生長天數(shù)的增加, 漆酶酶活逐漸增加, 在第1215天之間出現(xiàn)酶活高峰, 雙孢蘑菇、平菇HF 、平菇67 圖2 各菌株液體培養(yǎng)生物量變化Fig . 2 The changes

14、 of b io masses i n li qu i dculture of each fungu s166. 42, 934. 20, 865. 65, 883. 63, 686. 47, 315. 21U /ml 。圖3 各菌株液體培養(yǎng)過程中漆酶活性變化Fig . 3 T i m e cour se of the L accase ac ti vitydur i ng the f l u i d cu ltu re21113 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 白腐真菌之所以能對基質(zhì)中的木質(zhì)纖維有很好的降解能力, 是因為其能產(chǎn)生降解木質(zhì)素的酶系; 白腐真菌產(chǎn)酶酶活的高低決定了降解能力的大小, 本試驗以檢測漆酶

15、酶活的大小為參考, 比較各菌株降解秸稈木質(zhì)素能力的大小。由圖4中可以看出, 6株白腐真菌在秸稈固態(tài)發(fā)酵中所產(chǎn)漆酶酶活力比液體搖瓶培養(yǎng)所產(chǎn)的酶活低, 其中榆黃蘑、平菇HF 以及平菇SN 所產(chǎn)漆酶酶活較高, 分別為601. 33, 648. 39, 582. 70U /ml 。綜上所述, 對比其它5株白腐菌菌株, 平菇HF 在PDA 平板、土豆液體培養(yǎng)基和稻草秸稈基質(zhì)中菌絲生長速度快, 能在較短時間內(nèi)布滿整個培養(yǎng)基, 生長優(yōu)勢明顯; 液態(tài)培養(yǎng)的菌體生物量最多; 在土豆液體和稻草秸稈發(fā)酵中分泌漆酶能力都較強。因此, 選出平菇HF 圖4 各菌株固態(tài)發(fā)酵過程中漆酶酶活變化過程F ig . 4 T i m

16、 e course of laccase activitydur i ng soli d fer m en tation作下一步的秸稈降解菌混合發(fā)酵的試驗。2. 2 秸稈降解菌的搭配組合及混合發(fā)酵21211 菌株兼容性試驗 在同一個P DA 平板上(圖5 可以看到, 康氏木霉的綠色菌絲占據(jù)了將近整個平板, 而平菇HF 的菌落最大直徑約為0. 8c m 。說明康氏木霉生長優(yōu)勢比白腐真菌明顯, 前者對后者產(chǎn)生了競爭抑制性作用, 因此將康氏木霉與白腐真菌需進行二步混合發(fā)酵, 即先在固態(tài)培養(yǎng)基中接入平菇HF , 待其生長一定時間后, 再接入康氏木霉。在實驗的下一步就要確定兩種菌的接種時間間隔。圖5 康

17、氏木霉和平菇HF 兼容性試驗平板菌落圖F ig . 5 T he f l at col on ies of co mpatib ility test w ith Pteurorus ostreatus HF and Trichoder m a kon i ngii1:W h ite co l ony of P t euroru s ostreatus H F ; 2:G reen col ony of T ri chod e rma koning ii21212 康氏木霉與平菇降解效果比較 由表2中的結(jié)果可以看出, 在秸稈發(fā)酵基中接種單個菌株培養(yǎng), 降解效果遠不如混合菌發(fā)酵降解的好:康氏木霉降

18、解纖維素能力較強, 但對木質(zhì)素的降解率卻很低, 而且因受木質(zhì)素降解限制的影響, 對秸稈纖維素的降解還是不如混合菌; 平菇HF 除了能產(chǎn)生降解木質(zhì)素的酶系以外, 也能產(chǎn)生一定量的纖維素酶, 但降解纖維素的能力卻混合發(fā)酵培養(yǎng)時, 從圖6中可以看出, 兩種菌株接種的時間間隔以6天為最適宜。間隔3天以下時, 因白腐真菌生長較緩慢, 此時接入康氏木霉會對其產(chǎn)生競爭性抑制, 木質(zhì)素降解率不高; 間隔9天以上時, 則白腐菌菌絲基本已長滿培養(yǎng)料, 此時再接入木霉, 后者生長不良, 纖維素的降解率也不高。從二步發(fā)酵的各組處理(表2 來看, 經(jīng)發(fā)酵處理后秸稈木質(zhì)素含量最低的是H12-T 10組合, 其平菇HF 生

19、長旺盛, 發(fā)酵周期長, 木質(zhì)素得到充分的降解, 但纖維素含量仍較高, 主要是接種間隔過長, 康氏木霉生長受到抑制; 而發(fā)酵后秸稈纖維素含量最低的組合是H6-T10, 這一組合的木質(zhì)素降解率也非常高, 僅次于H12-T 10組合, 因此選取組合H6-T10, 其木質(zhì)素降解率達到44. 77%,纖維素的降解率為41. 48%。表2 平菇HF 和康氏木霉秸稈固態(tài)發(fā)酵后秸稈的木質(zhì)素、纖維素含量的測定T ab l e 2 Th e d eter m i nat i on of lign i n and cell u lose in stra w af ter th e soli d ferm en ta

20、tion of P teuroru s ostreatusH F and Trichoder m a kon i ngii混合培養(yǎng)方式木質(zhì)素含量/%纖維素含量/%H 3-T67. 2922. 38H 3-T87. 3421. 43H 3-T106. 8820. 52H 6-T65. 6722. 02H 6-T85. 2520. 47H 6-T105. 1220. 26H 9-T65. 2724. 37H 9-T85. 2124. 11H 9-T105. 1023. 45H 12-T65. 5424. 09H 12-T85. 3225. 39H 12-T105. 0924. 72平菇HF(單菌培

21、養(yǎng)20天 5. 4724. 81康氏木霉(單菌培養(yǎng)20天8. 1222. 733 結(jié) 論從6支可食用的白腐菌中挑選出生長旺盛、降解木質(zhì)素能力高的平菇HF , 其菌絲平均生長速度為0. 97c m /d ; 生物量在第18天時可達到最高值0. 4418g ; 液體搖瓶培養(yǎng)所產(chǎn)生的漆酶最高酶活為934. 20U /m, l 秸稈固態(tài)發(fā)酵所產(chǎn)生的漆酶最高酶活為648. 39U /ml 。 將降解木質(zhì)素的平菇HF 和降解纖維素的康氏木霉做平板拮抗試驗, 發(fā)現(xiàn)康氏木霉生長優(yōu)勢較強, 對白 腐菌有競爭性抑制作用。因此, 需將兩種菌進行二步圖6 各組合方式發(fā)酵后秸稈的木質(zhì)素、纖維素降解率F i g . 6

22、Th e d egradati on rate of li gnin and cellu l oseafter each co mb i n ati on m ode fermen tation混合發(fā)酵降解秸稈。由不同的混合發(fā)酵方式所產(chǎn)生的降解效果來看, H 6-T10組合最適宜, 降解效果最好, 木質(zhì)素的降解率為44. 77%,纖維素的降解率為41. 48%。參考文獻1黃忠乾、龍章富, 彭衛(wèi)紅, 等. 農(nóng)作物秸稈資源的綜合利用.資源開發(fā)與市場, 1999, 15(1:3234H uang Z Q ,Long Z F ,Peng W H,et a. lR esourcesDevel op m

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