山東玫瑰花的過氧化物酶同工酶分析

1、山東玫瑰花的過氧化物酶同工酶分析    【摘要】  目的建立山東不同品種玫瑰花藥材的過氧化物酶同工酶鑒別方法。方法 聚丙烯酰胺凝膠電泳法。結(jié)果19個(gè)品種的玫瑰花過氧化物酶同工酶分析，顯現(xiàn)出譜帶15條，其中D1帶和D2帶是玫瑰的基本譜帶。結(jié)論山東產(chǎn)玫瑰花各品種過氧化物酶同工酶的譜型較多，品種之間有較明顯的差異，可作為玫瑰花栽培品種鑒別的依據(jù)，為玫瑰花的規(guī)范化栽培提供了資料。 【關(guān)鍵詞】  玫瑰花；過氧化物酶同工酶；電泳；品種鑒別Abstract：ObjectiveTo establish a Peroxidase isoenzyme(P

2、OD) method for identification of rugosa rose varieties in Shandong province.MethodsThe polyacrylamide gel electrophoresis method was applied. ResultsPeroxidase zymograms of the  19 species were analyzed.The results showed that there were one to five belts， of which D1 and D2 were basic. Conclus

3、ionThe significant difference of POD zymograms among rugosa rose varieties in Shandong can be used as a foundation， which will provide information for normalized cultivation.Key words： Rugosa rose；  Peroxidase isoenzyme；  Electrophoresis；  Variety identification    玫瑰花是

4、薔薇科植物玫瑰Rosa rugosa Thumb.的干燥花蕾1，具有行氣活血、開竅化淤、疏肝醒脾的功效。河南學(xué)術(shù)科研網(wǎng)在我國(guó)已有二千多年的栽培歷史，主產(chǎn)于山東、甘肅、安徽、浙江、河北、內(nèi)蒙古等地2。山東作為玫瑰花的道地產(chǎn)區(qū)，匯集了當(dāng)今玫瑰的主要品種。2005版中國(guó)藥典對(duì)玫瑰花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載的較少，并且在不少地區(qū)發(fā)現(xiàn)其混淆品現(xiàn)象。我們?cè)鴮?duì)山東玫瑰花的生產(chǎn)栽培情況進(jìn)行了調(diào)查研究3，并對(duì)其進(jìn)行了研究進(jìn)展分析4、生藥學(xué)研究5和揮發(fā)油的GC?MS分析6。在此基礎(chǔ)上，“山東玫瑰花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及方法研究”和“山東玫瑰花的生藥學(xué)研究”課題組又利用聚丙烯酰胺凝膠電泳法對(duì)山東產(chǎn)19個(gè)品種的玫瑰花進(jìn)行了過氧化物酶同工

5、酶分析，為玫瑰花栽培品種的鑒別提供依據(jù)。1 材料與儀器1.1 藥材采集各品種玫瑰花藥材的莖尖、嫩芽，立即于4以下貯存?zhèn)溆?。藥物材料見?。1.2 儀器DYY?III2穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京市六一儀器廠），DYCZ?28A型垂直板電泳槽（北京市六一儀器廠），BCD?225AG型電冰箱，電熱恒溫培養(yǎng)箱，離心機(jī)，JA1203型電子分析天平，真空干燥器，微量進(jìn)樣器，定量可調(diào)微量移液器，燒杯，量筒，刻度吸管，離心管，大培養(yǎng)皿，玻璃注射器，剪刀，研缽等。1.3 試劑分離膠緩沖液，分離膠貯液，濃縮膠緩沖液，濃縮膠貯液，電極緩沖液，40%蔗糖溶液，過硫酸銨溶液，四甲基乙二胺，溴酚藍(lán)指示劑，醋酸聯(lián)苯胺顯色液，脫色

6、液等。所用生化試劑均為分析純。2 方法2.1 樣品液的制備取新鮮樣品25 g，加適量稀釋4倍的電極緩沖液，冰浴研磨成勻漿，冷凍離心機(jī)中3 000 r/min離心15 min，取其上清液，加入等體積蔗糖溶液，混勻，存于冰箱內(nèi)備用。整個(gè)制備過程中保持樣品溫度不超過4。表1  藥物材料（略）2.2 電泳槽的安裝垂直板電泳槽的式樣很多，目前流行的是用有機(jī)玻璃做的由兩個(gè)半槽組成的方形或長(zhǎng)方形電泳槽。兩半槽之間夾著凝膠模子，模子的兩側(cè)形成正負(fù)兩個(gè)槽，供裝電極緩沖液用。凝膠模子由兩塊玻璃裝入一個(gè)塑料或硅酮橡膠的夾套內(nèi)構(gòu)成。    玻璃板先用熱的去污劑輕輕擦洗或用洗液浸

7、泡，然后用水沖洗干凈，最后用蒸餾水沖洗，直立干燥，禁止用手接觸潔凈的玻璃板面。手持玻璃板兩邊，將兩塊玻璃板裝入夾套內(nèi)，然后垂直地放入半槽之間，長(zhǎng)螺桿固定。上螺絲時(shí)，要按順序逐步擰緊，均勻用力。電泳槽裝好后，將瓊脂熔化，趁 熱注入正極槽的小池內(nèi)，使在凝膠模子的下部凝結(jié)成約5 mm厚的瓊脂層。百事通2.3 分離膠與濃縮膠的制備將分離膠緩沖液、分離膠貯液、過硫酸銨溶液、蒸餾水按1214的比例（V/V）混合，配成分離膠液16ml；將濃縮膠緩沖液、濃縮膠貯液、過硫酸銨溶液、40%蔗糖溶液按1214的比例（V/V）混合，配成濃縮膠液4 ml。將配好的兩種膠液及2050 ml新鮮蒸餾水置真空干燥器內(nèi)抽氣20

8、 min。    分離膠液中加入四甲基乙二胺30 l，混勻，立即緩緩注入已安裝好的凝膠模子中，注意防止氣泡。分離膠液上覆蓋約3 mm后的蒸餾水，靜置1 h以上，待分離膠與水層間界面清晰時(shí)，用濾紙條小心吸凈水層。插上樣品槽模板，使其底部距分離膠上層約1 cm。向濃縮膠液中加入四甲基乙二胺15 l，混勻后注入凝膠模子中，靜置30 min，濃縮膠變?yōu)槿榘咨怪毕蛏闲⌒娜〕鰳悠凡勰０?。向正?fù)電極槽內(nèi)加入電極緩沖液共約800 ml，兩槽內(nèi)液面介于高低玻璃板之間。 2.4 點(diǎn)樣用微量注射器吸取樣品液2040l，注入樣品槽底部即可。2.5 電泳將電泳槽正負(fù)極分別與電

9、泳儀的正負(fù)極相連，在負(fù)極槽電極緩沖液中加溴酚藍(lán)指示劑12滴，打開電源，開始電泳。電泳采用穩(wěn)流控制，開始時(shí)電流15 mA，當(dāng)樣品達(dá)到分離膠與濃縮膠界面時(shí)，增大電流至25 mA。為子止溫度過高，可將電泳槽放在冰箱內(nèi)，當(dāng)溴酚藍(lán)前沿行至距瓊脂層約1 cm時(shí)，停止電泳，整個(gè)過程約需3 h。2.6 染色與保存打開電泳槽，取出膠板，標(biāo)記前沿。將膠板浸于預(yù)先配好的顯色液內(nèi)，加幾滴雙氧水，510 min后出現(xiàn)清晰的藍(lán)色譜帶。3 結(jié)果3.1 泳動(dòng)率的計(jì)算作為示蹤指示劑的溴酚藍(lán)在不同濃度的凝膠中，遷移速度基本相同，且分子篩效應(yīng)小，近似于自由電泳，電泳過程中始終位于最前沿。按下列公式計(jì)算玫瑰花各樣品的主要鑒別譜帶泳動(dòng)

10、率。結(jié)果見表2。表2  山東玫瑰花的過氧化同工酶的Rf值（略）泳動(dòng)率（Rf）=譜帶泳動(dòng)距離示蹤指示劑泳動(dòng)距離3.2 電泳圖譜的測(cè)繪 根據(jù)各樣品譜帶的泳動(dòng)率和譜帶形態(tài)及出現(xiàn)的先后順序，繪制電泳圖譜。結(jié)果見圖1。4 討論    電泳圖譜顯示，19個(gè)品種的玫瑰花過氧化物酶同工酶分析，其譜帶從負(fù)極到正極，顯現(xiàn)出譜帶15條。其中16個(gè)品種具有D1帶和D2帶，品種間差異不明顯，只有平陰四號(hào)、刺果、大紅花3個(gè)品種缺少這兩個(gè)譜帶。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析，平陰四號(hào)、刺果都具有蔓生的特點(diǎn)，是玫瑰與薔薇的雜交變種；大紅花具有枝條直立、花托杯狀、多次開花的月季特征，是玫瑰與月季間某

11、一品種的雜交變種。所以，作者認(rèn)為玫瑰花過氧化物酶同工酶譜帶中D1帶和D2帶是玫瑰的基本譜帶，而玫瑰與其他薔薇類雜交所產(chǎn)生的品種大多不具有此特征的譜帶。當(dāng)然，在品種的進(jìn)化過程中也有例外，如紫枝便具有D1帶和D2帶，可能與其在雜合過程中更多地遺傳了玫瑰的特征，這有待于進(jìn)一步探討研究。根據(jù)所繪電泳圖譜，可以將玫瑰花過氧化同工酶譜帶分為兩大類9個(gè)譜型。第1類為缺少D1帶和D2帶的，分為3種譜型：型，具有D5帶和D6帶如平陰四號(hào)。型，只有D6帶如刺果。型，具有D3帶、D4帶和D6帶如大紅花。第2類為具有D1帶和D2帶的，分為6種譜型：型，具有D6帶的6個(gè)品種如平陰一號(hào)、平陰十一號(hào)、西胡一號(hào)、西胡二號(hào)、西

12、胡三號(hào)、重瓣白。型，具有D5帶的4個(gè)品種如豐花、傳統(tǒng)、紫枝、繁花。型，具有D3帶、D4帶和D6帶的2個(gè)品種如單瓣紅、粉色。型，具有D5帶和D6帶的2個(gè)品種如平陰三號(hào)、平陰十二號(hào)。型，具有D3帶和D4帶的是平陰二號(hào)。型，具有D3帶和D5帶的是單縣玫瑰。    過氧化酶同工酶分析在栽培品種的鑒定上更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定，因?yàn)橥っ傅慕Y(jié)構(gòu)差異主要來源于基因差異，利用它可以鑒別諸多基因變異。如生物的類別、品種的地理分布、演化關(guān)系7?？傊?，山東產(chǎn)玫瑰花各品種過氧化物酶同工酶的譜型較多，品種之間有較明顯的差異，可以作為玫瑰花栽培品種鑒別的依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1國(guó)家藥典委員

13、會(huì).中國(guó)藥典，部S.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005.2國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草，上冊(cè)M.上海:上?？萍汲霭嫔?，1996：788.3李明，彭艷麗，韓 莉，等.山東玫瑰花的生產(chǎn)情況調(diào)查J.山東中醫(yī)雜志，2005，10（3）:196.4李明，彭艷麗，韓 莉，等.中藥玫瑰花的研究進(jìn)展J.衛(wèi)生職業(yè)教育，2007，25（8）:146.5 李明，彭艷麗，牟宗慧.山東玫瑰花的生藥學(xué)研究J.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26（1）:109.6李明，彭艷麗，韓 莉，等.不同品種玫瑰花揮發(fā)油化學(xué)成分的GC?MS分析J.中成藥，2008，30（5）:104.7黃壽松.幾種植物中的過氧化物酶同工酶分析J.遺傳，1980，2(3):7.百事通&#