DNA粗提取和鑒定實(shí)驗(yàn)

1、DNA的粗提取與鑒定實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)原理DNA主要存在于細(xì)胞核DNA在NaCl溶液中的溶解度，是隨著NaCl的濃度的變化而改變的。當(dāng)NaCl的物質(zhì)的量濃度為0.14 molL時(shí),DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)可以溶于酒精溶液。利用這一原理，可以進(jìn)一步提取出含雜質(zhì)較少的DNA。DNA遇二苯胺（沸水浴）會染成藍(lán)色，因此，二苯胺可以作為鑒定DNA的試劑。二、實(shí)驗(yàn)材料和用具雞血細(xì)胞液（510ml）；體積分?jǐn)?shù)為95%的冷酒精溶液（實(shí)驗(yàn)前置于冰箱內(nèi)冷卻24h）；蒸餾水；質(zhì)量濃度為0g/ml的檸檬酸納溶液；質(zhì)量的濃度分別為2

2、mol/L和0015mol/L的氯化納溶液（新教材不要求0、015的濃度了，都是用的2mol/L）；二苯胺試劑；鐵架臺；鑷子；水浴鍋；玻璃棒；濾紙；滴管；量筒（100ml，一個(gè)）；燒杯；（1000ml，一個(gè)，50ml、100 ml 、500ml各二個(gè)）；試管（20ml，二個(gè)）；漏斗；試管夾；紗布。 三、課前準(zhǔn)備雞血細(xì)胞液取質(zhì)量濃度為01g/ml的檸檬酸納溶液（抗凝劑）100ml，置于500ml燒杯中。注入新鮮的雞血（約180ml），同時(shí)用玻璃棒攪拌，使血液與檸檬酸納溶液充分混合，以免凝血。將燒杯中的血液置于冰箱內(nèi)，精置一天，使血細(xì)胞自行沉淀。（也可以將血液倒入離心管內(nèi)，用1000r/min（轉(zhuǎn)

3、每分）的離心機(jī)離心2min，血細(xì)胞沉淀于離心管底部。實(shí)驗(yàn)時(shí)。用吸管除去離心管上部的澄清液，就可以得到雞血細(xì)胞液。四、方法步驟 提取雞血細(xì)胞的細(xì)胞核物質(zhì)將制備好的雞血細(xì)胞液5 mL10mL，注入到50 mL燒杯中。向燒杯中加入蒸餾水20 mL，同時(shí)用玻璃棒充分?jǐn)嚢? min，使血細(xì)胞加速破裂。然后，用放有1-2層紗布的漏斗將血細(xì)胞液過濾至1000mL。取其濾液。溶解細(xì)胞核內(nèi)的DNA將氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2 mol/L的溶液40mL加入到濾液中，并用玻璃棒沿一個(gè)方向攪拌1min，使其混合均勻，這時(shí)DNA在溶液中呈溶解狀態(tài) 。析出含DNA的粘稠物沿?zé)瓋?nèi)壁緩緩加入蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒不停地輕輕攪

4、拌，這時(shí)燒杯中有絲狀物出現(xiàn)，注意觀察絲狀物呈什么顏色。繼續(xù)加入蒸餾水，溶液中出現(xiàn)的粘稠物會越來越多。當(dāng)粘稠物不再增加時(shí)停止加入蒸餾水（這時(shí)溶液中氯化鈉的物質(zhì)的量濃度相當(dāng)于0.14 molL）經(jīng)驗(yàn)值：需加約570mL蒸餾水，且分多次加入。將溶液中的DNA與其他雜質(zhì)分離，這一步驟是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該緩慢貼壁加入蒸餾水，并輕輕地沿一個(gè)方向不停地均勻攪拌，以利于DNA分子的附著和纏繞。濾取含DNA的粘稠物用放有多層紗布的漏斗，過濾步驟3中的溶液至 500mL的燒杯中，含 DNA的粘稠物被留在紗布上，濾液丟棄。將DNA的粘稠物再溶解取 1個(gè) 50 mL燒杯，向燒杯內(nèi)注入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為 2

5、 molL的溶液 20mL。用鈍頭鑷子將紗布上的粘稠物夾至氯化鈉溶液中，用玻璃棒不停地?cái)嚢?，約3分鐘，使粘稠物盡可能多地溶解于溶液中。過濾含有DNA的氯化鈉溶液取1個(gè)100 mL燒杯，用放有兩層紗布的漏斗過濾步驟5中的溶液。取其濾液，DNA溶于濾液中。提取含雜質(zhì)較少的DNA在上述濾過的溶液中，加入等體積的、冷卻的、體積分?jǐn)?shù)為 95的酒精溶液 （使用冷卻的酒精，對DNA的凝集效果較佳），并用玻璃棒攪拌，溶液中會出現(xiàn)含雜質(zhì)較少的白色絲狀物。用玻璃棒將絲狀物卷起，并用濾紙吸取上面的水分。這種絲狀物的主要成分就是DNA。 DNA的鑒定取兩支20 mL的試管，各加入氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為0015 mol

6、L的溶液5 mL，將絲狀物放入其中一支試管中，用玻璃棒攪拌，使絲狀物溶解。然后，向兩支試管中各加入4mlL的二苯胺試劑。混合均勻后，將試管置于沸水中加熱 5 min，待試管冷卻后，觀察并且比較兩支試管中溶液顏色的變化。五、討論兩次使用蒸餾水第一次：細(xì)胞吸水脹破 第一步第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步三次過濾第一次： DNA存在于濾液里 第一步第二次： DNA被留在紗布上 第四步第三次： DNA存在于濾液里 第六步過濾時(shí)使用的紗布層數(shù)與需用濾液或黏稠物有關(guān)，第二次要用其濾出的黏稠物有關(guān)，所以要使用多層紗布，第一次和第三次均要用其濾液，使用的紗布為12層兩次析出第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含雜質(zhì)多 第三步第二次：用冷卻的95的酒精 第七步六次攪拌：第一、二、三、五、七、八步其中除第八步外，其余均要朝一個(gè)方向攪拌，在第三、五步攪動還要輕緩，玻璃棒不要直插燒杯底部，這樣才能保證得到完整的DNA為什么反復(fù)地溶解與析出DNA，能夠去除雜質(zhì)？答：用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質(zhì)；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質(zhì)。因此，通過反復(fù)溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解