苦參堿對(duì)單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成及PPARγcaveoli

1、苦參堿對(duì)單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成及PPAR，caveolin?1表達(dá)的影響    【摘要】 目的: 觀察苦參堿對(duì)ox?LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞內(nèi)膽固醇脂和PPAR?, 小凹蛋白?1表達(dá)的影響. 方法: 用熒光分光光度法測(cè)定膽固醇濃度;采用TBARS法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物；用油紅O染色法檢測(cè)泡沫細(xì)胞的形成；用熒光RT?PCR和Western Blot檢測(cè)PPAR, caveolin?1的表達(dá). 結(jié)果: 單核細(xì)胞經(jīng)PMA及oxLDL共同孵育后，細(xì)胞內(nèi)形成大量脂滴，膽固醇酯(CE)和細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(MDA)含量由(3.4±0.6)

2、mg/L, (0.43±0.07) nmol/L升至(64.8±6.8) mg/L, (8.50±1.23) nmol/L (P<0.05)，泡沫細(xì)胞由(4.7±2.2)%升至(77.8±7.0)% (P<0.05)，而PPAR? mRNA和PPAR?,小凹蛋白?1蛋白表達(dá)由（4.4±0.8）, （0.5±0.09）, （0.6±0.09）降至（1.6±0.4）, （0.33±0.09）, （0.33±0.09）(P<0.05)，苦參堿低、中、高干預(yù)組細(xì)胞內(nèi)積聚的CE

3、和MDA含量分別為 (29.7±4.9) mg/L, (1.92±0.46) nmol/L, (5.8±1.3) mg/L, (0.6±0.08) nmol/L, (3.4±0.6) mg/L, (0.43±0.07) nmol/L;泡沫細(xì)胞為(46.2±5.8)%, (16.3±3.4)%, (4.8±1.5)%, PPAR? mRNA和PPAR?, 小凹蛋白?1蛋白表達(dá)為（6.4±2.2）, （0.6±0.08）, （0.5±0.09）, （7.4±2.2）,

4、（0.6±0.08）, （0.6±0.07）, （8.6±2.7）, （0.6±0.06）, （0.7±0.06），與ox?LDL PMA組比較有顯著性差異(P<0.05). 結(jié)論: 苦參堿減少ox?LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成及細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚集，增加泡沫細(xì)胞內(nèi)PPAR?,小凹蛋白?1的表達(dá).    【關(guān)鍵詞】 苦參堿;泡沫細(xì)胞;過(guò)氧化增殖物激活型受體?;膽固醇;小凹蛋白?1 0引言 動(dòng)脈粥樣硬化一個(gè)重要的特征是單核細(xì)胞進(jìn)入損傷的動(dòng)脈壁進(jìn)而分化為巨噬細(xì)胞. 這些巨噬細(xì)胞吞噬大量的脂質(zhì)變?yōu)榕?/p>

5、沫細(xì)胞1. 在人類和小鼠粥樣斑塊損傷中可見過(guò)氧化物酶增殖物激活受體(PPAR?)明顯表達(dá)，提示PPAR?在動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用. 小凹蛋白?1(caveolin?1)具有結(jié)合和運(yùn)載膽固醇的功能,并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇流出,對(duì)維持正常細(xì)胞膽固醇的穩(wěn)態(tài)起著重要調(diào)節(jié)作用2. 苦參中的活性成分苦參堿（Matrine）具有較為廣泛的生物學(xué)作用3. 但其抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制目前尚不清楚. 本實(shí)驗(yàn)我們以ox?LDL誘導(dǎo)的單核細(xì)胞形成的泡沫細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?觀察苦參堿對(duì)膽固醇脂,PPAR,小凹蛋白?1表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討苦參堿在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用. 1材料和方法 1.1材料RPMI? 1640培

6、養(yǎng)基購(gòu)自GIBCO公司；胎牛血清購(gòu)自天津市正江高科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA), 佛波酯（PMA）, 油紅O, 靛藍(lán)胭脂紅, 膽固醇氧化酶, 膽固醇酯酶均購(gòu)自Sigma公司；膽酸鈉美國(guó)Amresco公司. 膽固醇購(gòu)自GourMet Cell Application公司；苦參堿(一種生物堿,具有四環(huán)的喹嗪啶類結(jié)構(gòu)，熔點(diǎn)75.577.5,純度99%, 溶于水),批號(hào)為20040625，分子質(zhì)量248.36，寧夏中藥廠提供. 1.2方法 健康人血漿購(gòu)自寧夏中心血站，按照常規(guī)方法分離、提純，提取的LDL以含0.1 g/L EDTA的Tris?HCl緩沖液(pH 7.6) 4透析48 h,過(guò)濾除菌

7、,考馬斯亮藍(lán)G?250法定量蛋白. 在分組干預(yù)時(shí)，使苦參堿終濃度達(dá)到以下分組的濃度4：對(duì)照組：對(duì)細(xì)胞沒(méi)有任何干預(yù)；ox?LDL PMA組：培養(yǎng)細(xì)胞中加入終濃度為0.5 mg/L的PMA, 100 mg/L的ox?LDL; 苦參堿低劑量組：培養(yǎng)細(xì)胞中加入終濃度為0.5 mg/L的PMA, 100 mg/L的ox?LDL, 2.5×10-4 mol/L的苦參堿；苦參堿中劑量組：培養(yǎng)細(xì)胞中加入終濃度為0.5 mg/L的PMA, 100 mg/L的ox?LDL, 5×10-4 mol/L的苦參堿；苦參堿高劑量組：培養(yǎng)細(xì)胞中加入終濃度為0.5 mg/L的PMA, 100 mg/L的o

8、x?LDL,1×10-3 mol/L的苦參堿，各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h. 按文獻(xiàn)5用熒光分光光度法測(cè)定各樣品的膽固醇濃度，測(cè)定游離膽固醇時(shí)，反應(yīng)液中省去膽固醇酯酶，膽固醇酯的含量用總膽固醇與游離膽固醇的差值獲得. 按照MDA測(cè)定試劑盒說(shuō)明書的方法，檢測(cè)MDA的含量及活性. 顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色. 400倍光鏡下非重復(fù)計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)出泡沫細(xì)胞所占的數(shù)量. 按Trizol試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，提取的RNA溶于適量DEPC水中，備用. 逆轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為50 L,總RNA 10 g, oligdT 2 L,混勻短暫離心,70預(yù)變性10 min,冰浴5 min;

9、加入MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶2 L, RNasin 1 L, dNTP 2 L, MMLV緩沖液10 L 40逆轉(zhuǎn)錄60 min, 94 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶. 熒光定量PCR引物序列資源自GenBank序列數(shù)據(jù)庫(kù). 根據(jù)基因的相對(duì)量=2-Ct，在該公式中，Ct是熱循環(huán)儀檢測(cè)到反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的強(qiáng)度值，Ct=CtGI（待測(cè)樣品）-CtGAPDH（待測(cè)樣品）- CtGI（校正樣品）-CtGAPDH（校正樣品）. GI是目的基因，校正樣品是任何被選做代表1倍目的基因表達(dá)量的樣品，使用這一方法可以直接得到目的基因相對(duì)于管家基因的定量. 按文獻(xiàn)方法6,待測(cè)樣品用BCA試劑測(cè)定蛋白含量后蛋白濃度以BCA法測(cè)

10、定. 采用BioRad Quantity 4.5.2軟件分析測(cè)定其區(qū)帶的感光密度,以actin為內(nèi)參照,用目的片段與actin的光密度比值表示蛋白質(zhì)表達(dá)水平. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 各樣本測(cè)定值以x±s表示，行方差分析(ANOVA)及多樣本均數(shù)的兩兩比較(LSD). 組間方差不齊時(shí),采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn),用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果 2.1苦參堿對(duì)激活的人單核細(xì)胞內(nèi)膽固醇積聚及脂質(zhì)過(guò)氧化的影響 經(jīng)ox?LDL處理后單核細(xì)胞內(nèi)TC,FC,CE及MDA的含量均增加（P<0.05），苦參堿可減少ox?LDL PMA所致的單核細(xì)胞內(nèi)TC,

11、FC,CE及MDA的含量的增加（P<0.05），但苦參堿低劑量組仍高于對(duì)照組(表1).表1各組人單核細(xì)胞內(nèi)膽固醇的積聚及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的比較(略)    2.2苦參堿對(duì)單核細(xì)胞泡沫化的影響 各組泡沫細(xì)胞的半定量結(jié)果如圖1，單核細(xì)胞的泡沫化形成如圖2，經(jīng)LDL PMA處理后油紅O染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分計(jì)數(shù)均顯著增加（P<0.05）， 苦參堿可顯著緩解LDL PMA所致的陽(yáng)性細(xì)胞的增加（P<0.05），但苦參堿低劑量組仍高于對(duì)照組. 2.3泡沫細(xì)胞PPAR mRNA,蛋白表達(dá)和小凹蛋白1蛋白表達(dá)的變化 經(jīng)LDL PMA處理后單核細(xì)胞內(nèi)PPAR

12、mRNA和PPAR,小凹蛋白?1蛋白表達(dá)均下降（P<0.05），苦參堿可增加PPAR mRNA和PPAR,小凹蛋白1蛋白表達(dá)（P<0.05），苦參堿劑量組與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3,4).    3討論 AS的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,研究表明,巨噬細(xì)胞膽固醇的聚集和泡沫細(xì)胞形成貫穿了AS的整個(gè)過(guò)程7. 抑制caveolin?1的表達(dá)可以使細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出受阻,從而加劇膽固醇和膽固醇脂的堆積,加重細(xì)胞泡沫化和動(dòng)脈粥樣硬化. PPAR?主要參與脂代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄基因調(diào)節(jié),可促使脂肪細(xì)胞分化. 研究顯示,單核巨噬細(xì)胞分化為泡沫細(xì)胞最突出的

13、特征是脂代謝變化,但調(diào)節(jié)脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的PPAR?對(duì)血管局部單核巨噬細(xì)胞的作用知之甚少.文獻(xiàn)報(bào)道8對(duì)體外細(xì)胞培養(yǎng)研究表明,在人巨噬細(xì)胞及巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞,配體活化的PPAR?通過(guò)caveolin?1基因表達(dá)降低和ApoAI介導(dǎo)的膽固醇流出途徑減少膽固醇酯合成,結(jié)果提示PPAR?在AS起重要作用. 我們研究發(fā)現(xiàn)，oxLDLPMA共同孵育的單核細(xì)胞明顯泡沫化,單核細(xì)胞內(nèi)TC,FC和CE均顯著增加，而且細(xì)胞內(nèi)MDA也明顯增多，這與以前的研究一致9. 在有苦參堿存在時(shí),泡沫細(xì)胞內(nèi)積聚的TC, FC和CE均明顯地減少; MDA以及泡沫細(xì)胞的數(shù)量均顯著減少；同時(shí)單核細(xì)胞PPAR mRNA和PPAR

14、,小凹蛋白?1蛋白表達(dá)增加,這些結(jié)果說(shuō)明,苦參堿可能作用于膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的起始步驟,苦參堿一方面抑制膽固醇酯化, 使膽固醇流出;另一方面苦參堿使PPAR表達(dá)上調(diào),同時(shí)PPAR?能使單核巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)分化過(guò)程中小凹蛋白?1蛋白表達(dá)水平明顯增加, 小凹蛋白?1主動(dòng)轉(zhuǎn)出膽固醇增加,從而細(xì)胞內(nèi)膽固醇聚積減少. 提示苦參堿可能通過(guò)PPAR小凹蛋白1表達(dá)增加抑制AS 提前發(fā)生. 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示苦參堿可能增強(qiáng)了PPAR mRNA和PPAR,小凹蛋白1蛋白表達(dá)，導(dǎo)致中泡沫細(xì)胞內(nèi)積聚的TC, FC與CE減少；從而達(dá)到治療和預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的作用,但苦參堿如何調(diào)控PPAR?,小凹蛋白?1的機(jī)制有待進(jìn)一步研究. 【參

15、考文獻(xiàn)】 1Fong IW. Infections and their role in atherosclerotic vascular diseaseJ.J Am Dent Assoc, 2002, 133(Suppl):7s-13s.2Ge S, Pachter JS.Caveolin?1 knockdown by small interfering RNA suppresses responses to the chemokine monocyte chemoattractant protein?1 by human astrocytesJ.J Biol Chem, 2004,279(8

16、):6688-6695.3王俊學(xué),王國(guó)俊.苦參堿及氧化苦參堿的藥理作用及臨床應(yīng)用J.肝臟,2000,l5(2):116-117.4Zeng XK, Dai J, Remick DG, et al. homocysteine mediated expression and secretion of monocyte chemoattractant protein?1 and interleukin?8 in human monocytesJ.Circulation Research,2003,9(3):311-321.5蔣佩, 嚴(yán)鵬科, 莫中成, 等. 促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出抑制單核細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞凋亡J. 中國(guó)病理生理雜志, 2005, 21(6): 1041-1045.6高雪,薛瑩,姜泓,等. 結(jié)核分枝桿菌furA基因片段的克隆、表達(dá)和分離純化J.第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2004,25(18):1637-160.7王宗仁,鄭瑾,馬愛(ài)玲，等.中藥芪丹通脈片對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)