第二章 微生物的生理

1、第二章 微生物的生理本章主要內(nèi)容第一節(jié) 細菌細胞的代謝過程第三節(jié) 細菌的人工培養(yǎng)第二節(jié) 細菌的生長繁殖第四節(jié) 病毒的增殖細菌與其他生物一樣，有獨立的生命活動，涉及復(fù)雜的新陳代謝。細菌的生理涉及細菌的組分、營養(yǎng)要求、能量代謝、生物生長合成繁殖及基因調(diào)控等。本章將以細菌群體的生長繁殖為主線，介紹細菌個體形成的代謝過程、群體的生長繁殖、細菌自身的調(diào)節(jié)機制以及工人培養(yǎng)條件下細菌對營養(yǎng)的需求。第一節(jié) 細菌細胞的代謝過程 細菌的新陳代謝包括菌細胞的生物合成、能量供給、運動以及多達2000種化學(xué)反應(yīng)表現(xiàn)的各種活性。形成菌細胞的代謝過程可按其功能分為物質(zhì)攝取、生物合成、聚合作用及組裝四個步驟（圖2-1）。進入

2、PO43-碳源SO42-NH3PO43-碳源SO42-NH3攝取細胞包膜還原能能量代謝前體生物合成脂肪酸（約8種）糖（約25種）氨基酸（約20種）核酸（約8種）聚合作用脂脂多糖糖原肽聚糖蛋白質(zhì)RNADNA組裝包含物包膜鞭毛菌毛胞漿液核糖體核苷酸圖2-1 細菌細胞的代謝過程示意圖（據(jù)Ryan等）細菌為原核單細胞生物，其新陳代謝與動物細胞有如下主要區(qū)別：第一，細菌生長和繁殖速度極快，超過動物細胞10至100倍。第二，細菌利用各種化合物作為能源的能力遠遠強于動物細胞。第三，細菌對營養(yǎng)的需求比動物細胞更為多種多樣，因為它們有多種代謝旁路。第四，細菌可利用非常流水線式生產(chǎn)的方式全成大分子物質(zhì)。第五，細菌

3、能產(chǎn)生諸如肽聚糖、脂多糖、磷壁酸等特殊物質(zhì)。一、物質(zhì)攝取（fueling）細菌的物質(zhì)吸收過程主要通過單純擴散、促進擴散、主動輸送及基團轉(zhuǎn)位等方式進出細菌細胞（圖2-2），涉及細胞的能量提供和十余種前體代謝物質(zhì)以及細胞膜和外膜蛋白的參與。圖2-2 細菌物質(zhì)攝取的各種方式（據(jù)Ryan）Pc：磷酸 HPr：含組氨酸的磷酸載體蛋白H2O，O2，CO2 甘油 乳糖 半乳糖 葡萄糖半乳糖結(jié)合蛋白H2O，O2，CO2甘油乳糖半乳糖6磷酸葡萄糖甘油轉(zhuǎn)運蛋白乳糖透性酶半乳糖轉(zhuǎn)運蛋白酶（一）單純擴散（simple diffusion）亦稱被動擴散。細胞膜兩側(cè)的物質(zhì)靠濃度差（濃度梯度）進行分子擴散，不需要能量，當細

4、胞內(nèi)外溶質(zhì)濃度達到平衡，擴散便停止。某些氣體（O2、CO2）、水、乙醇及甘油等水溶性小分子以及某些離子（Na+）等以此方式運輸。（二）促進擴散（facilitated diffusion）某些物質(zhì)如糖或氨基酸與某些位于細胞膜的特異性載體蛋白（carrier protein）相結(jié)合，而后將其轉(zhuǎn)運至細胞內(nèi)，這一過程具有特異性和選擇性，也不需要能量。甘油進入大腸桿菌等腸道菌的細胞內(nèi)，厭氧菌吸收營養(yǎng)物質(zhì)及排出代謝產(chǎn)物，均是通過這一方式。載體蛋白在革蘭氏陰性菌屬于OMP，可能是通過構(gòu)象改變而完成促進擴散的。（三）主動輸送（active transport）是細菌吸收營養(yǎng)物質(zhì)的一種主要方式，與促進擴散一樣

5、，需要特異性的載體蛋白，能將特異性溶質(zhì)逆濃度梯度“泵”入細胞，因此需要能量。革蘭氏陰性菌有兩種主動輸送的方式：休克敏感式（shock-sensitive）及休克不敏感式（shock-insensitive）。在作滲透休克處理時，前者載體蛋白釋放出所結(jié)合的可溶性分子如半乳糖，通過細菌外膜的微孔進入細胞，該過程伴隨ATP的水解。休克不敏感伴隨H+的跨膜，其能量由獲能的細胞膜的電子運輸而獲得，有特異性載體蛋白（透性酶）參與，乳糖的輸送即用此方式。（四）基團轉(zhuǎn)位（group translocation）物質(zhì)在運輸?shù)耐瑫r受到化學(xué)修飾，從而能源源不斷輸入細胞，此種方式在缺氧環(huán)境中最為常見。其過程涉及從可溶

6、物向分子的化學(xué)變化，需要特異性載體蛋白參與，需要能量。有磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphotransferase system）參與的葡萄糖磷酸化是個例證。（五）金屬離子的吸收影響細菌生長的金屬離子在動物體內(nèi)極少以游離狀態(tài)存在，以鐵為例，它與鐵結(jié)合蛋白結(jié)合，如血清中的轉(zhuǎn)鐵蛋白及乳中的乳鐵蛋白。細菌通過分泌載鐵體攫取這些蛋白結(jié)合的Fe3+，形成含鐵螯合物，而后通過特異的主動輸送，F(xiàn)e3+進入菌體細胞。 O Fe3+ | OC=O|NH|Cyclo(COCHCH2O)3圖2-3 大腸桿菌的氣菌素載鐵體（siderophore） 是細菌在低鐵條件下所產(chǎn)生的一類有機化合物，分子量一般不超過1000，與Fe

7、3+有極強的親合力。其合成受鐵調(diào)控，輸送鐵的功能與細菌外膜的受體有關(guān)。目前將載鐵體分為兩種類型，一種為異羥肟鹽類（hydroxamate），具有單個或兩個異羥肟酸功能團，氣菌素（aerobactin）是其代表（圖2-3），能抵抗血清的滅活作用。另一種為酚鹽類（phenolate），由2,3-二羥基苯甲酸（2,3-DHS）與氨基酸偶聯(lián)而成，腸菌素（enterobactin）是其代表，能被血清滅活。大腸桿菌具有這兩種載鐵體。二、生物合成（biosynthesis）吸收的各種前體代謝物通過代謝途徑的網(wǎng)絡(luò)，合成多種氨基酸、核苷酸、糖、脂肪酸及其他合成大分子所需物質(zhì)（圖2-1）。此過程還需要碳的前體、還

8、原的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸鹽（NADPH）、ATP、氨基氮以及硫。不同種類細菌對營養(yǎng)的需要有所不同，又有其不同的合成途徑，據(jù)此可作為細菌實驗室鑒定的重要指標。三、聚合作用（polymerization）圖2-4 大腸桿菌染色體的復(fù)制叉（據(jù)Madigan等）細菌DNA的聚合作用稱為復(fù)制。其DNA復(fù)制從基因組的特定起始部位開始，而后沿環(huán)狀的染色體DNA的復(fù)制叉（replication fork）部位，從5端到3端雙向進行（圖2-4）。以半保留（semiconservative）方式復(fù)制，其DNA雙鏈解離，其中一條鏈作為母板合成互補鏈。另一條鏈則沿相反方向復(fù)制，最后由酶連接成完成DNA鏈（圖2-5

9、）。細菌DNA復(fù)制的頻率因細菌細胞的生長率而異，DNA鏈的延伸率（elongation rate）則相對穩(wěn)定。復(fù)制叉新合成的DNA復(fù)制起始部位圖2-5 大腸桿菌染色體DNA的復(fù)制過程示意圖（據(jù)Madigan等）某些抗生素以不同途徑干擾細菌DNA的復(fù)制，例如新生霉素等抑制細菌DNA復(fù)制過程中所需的促旋酶的活性。（一）轉(zhuǎn)錄1. 細菌的轉(zhuǎn)錄特點：在某些方面與真核生物不同。細菌可由同一個RNA聚合酶催化合成細菌的mRNA、tRNA及rRNA。該酶還可像真核生物那樣利用活化的ATP、GTP、CTP及UTP，并可作為母板合成DNA互補鏈。細菌mRNA不需要通過核膜轉(zhuǎn)運到胞漿，因此不需要聚A帽狀結(jié)構(gòu)，也不要

10、特異的轉(zhuǎn)運方式，而且在mRNA合成早期直接與核糖體蛋白結(jié)合形成多聚體。2. RNA聚合酶：該酶是一個復(fù)雜的大分子，由21亞單位組成。亞單位可與特異的DNA序列即啟動子（promoter）結(jié)合。細菌RNA聚合酶一般具有一個以上的亞單位，可識別不同的啟動子，從而激活相關(guān)的基因。RNA聚合酶是利福平類藥物的靶分子，其可阻斷轉(zhuǎn)錄的起始。3. RNA的加工修飾：像真核細胞一樣，RNA大分子的前體被核酸酶等加工、修飾，而后產(chǎn)生穩(wěn)定的RNA分子如tRNA、rRNA等。（二）翻譯也稱轉(zhuǎn)譯，是蛋白質(zhì)合成過程。20種氨基酸激活后與相應(yīng)的tRNA結(jié)合，形成的氨基酰-tRNA通過某些可溶性蛋白因子與核糖體結(jié)合。在此過

11、程中，氨基酸根據(jù)mRNA上的密碼子序列聚合成多肽。tRNA釋放出氨基酸后，自身也從核糖體上脫落，并進入下一輪氨基酰循環(huán)。多種抗生素以細菌翻譯過程有抑制作用，氯霉素、林可霉素和紅霉素等抑制核糖體大亞基，四環(huán)素、鏈霉素和壯觀霉素等抑制小亞基，還有一些作用于核鏈孢酸（fusidic acid）等可溶性蛋白因子，后者參與多肽的合成。以上過程在原核細胞和真核細胞基本一致，但存在一些差別。細菌核糖體較小，結(jié)構(gòu)也較簡單。細菌的mRNA不需要經(jīng)過加工和轉(zhuǎn)運，為大的順反子，包含多個基因，可指導(dǎo)多個多肽鏈的合成。細菌RNA聚合酶合成mRNA的速率為55個核苷酸/秒（37），核糖體合成多肽鏈的速率為18個氨基酸/秒

12、。因此細菌中mRNA的翻譯與DNA的轉(zhuǎn)錄不僅同時進行，而且兩者速率也相等（每秒55個核苷酸/每個密碼子3個核苷酸=每秒18個氨基酸），這意味著核糖體在mRNA鏈上移動速率與RNA聚合酶合成mRNA的速率相等。細菌的上述翻譯特性決定了細菌高效合成過程。細菌胞質(zhì)內(nèi)充滿多聚核糖體。每個核糖體幾乎都最大限度地發(fā)揮作用。細菌生長越快，需要合成蛋白質(zhì)用的核糖體就越多。在豐富培養(yǎng)基上生長的大腸桿菌，一半以上菌體由核糖體和其它翻譯組分構(gòu)成。四、組裝（assembly）細菌細胞結(jié)構(gòu)的組裝有兩種方式：自我組裝（self-assembly，又名自我凝聚），及指導(dǎo)組裝（guided assembly，又名特異機制）。

13、自我組裝可在體外試管內(nèi)完成，鞭毛及核糖體即采用此種方式。細菌表面膜結(jié)構(gòu)則只能依賴指導(dǎo)組裝來完成，過程尚不完全清楚，涉及蛋白質(zhì)的分泌，跨膜運輸及載體分子如細菌萜醇等。桿菌肽或萬古霉素可干擾細菌細胞成份組裝所需的載體的功能，多粘菌素可影響細胞膜的組裝。返回第二節(jié) 細菌的生長繁殖 細菌生長繁殖分別體現(xiàn)在個體和群體兩方面。一、細菌個體的生長繁殖細菌以均等二分裂（binary fission）方式進行無性繁殖。已知大腸桿菌菌體的分裂過程涉及30多個基因的調(diào)控。一個菌體分裂為兩個菌體所需的時間稱為世代時間（generation time）。細菌種類不同其分裂的世代時間有所差異，大腸桿菌及許多其他病原菌在適

14、宜的條件下，分裂一次僅需20 min，而分枝桿菌等繁殖較慢，需1824 h才分裂一次。某些抗生素可抑制細菌聚合作用及組裝，如使用非致死濃度的這些抗生素，可影響細胞的分裂，導(dǎo)致菌體形態(tài)異常，如使用抗生素的樣本中的大腸桿菌，往往呈長絲狀。二、細菌群體的生長繁殖如將細菌接種在液體培養(yǎng)基并置于適宜的溫度中，定時取樣檢查活菌數(shù)，可發(fā)現(xiàn)其生長過程具有規(guī)律性。以時間為橫坐標，以活菌數(shù)的對數(shù)為縱坐標，可得出一條生長曲線（growth curve）。曲線顯示了細菌生長繁殖的4個期（圖2-6）。 9 8 7 穩(wěn)定期 衰亡期 6 5 對數(shù)期 4 3 2 1 遲緩期 04 8 12 16 20 24 28 32 26

15、 h圖2-6 細菌的生長曲線（一）遲緩期（lag phase）是細菌植入到新環(huán)境后的一個適應(yīng)階段。此時菌體增大，代謝活躍，合成并積累所需酶系統(tǒng)。RNA含量明顯增多，但DNA的量無變化，此時細菌數(shù)并不增加。這一過程一般約需14 h。（二）對數(shù)期（logarithmic phase）細菌此時生長迅速，以恒定速度進行分裂繁殖，活菌數(shù)以幾何級數(shù)增長，達到頂峰，生長曲線接近一條斜的直線。一般而言，該期的病原菌致病力最強，其形態(tài)、染色特性及生理活性均較典型，對抗菌藥物等的作用較為敏感。大腸桿菌的對數(shù)期可持續(xù)610 h。（三）穩(wěn)定期（stationary phase）此時因營養(yǎng)的消耗、代謝產(chǎn)物的蓄積等，細菌

16、繁殖速度下降，死亡數(shù)逐步上升，新繁殖的活菌數(shù)與死菌數(shù)大致持平。該期細菌的形態(tài)及生理性狀常有改變，革蘭氏陽性菌此時可染成陰性。毒素等代謝產(chǎn)物大多此時產(chǎn)生。大腸桿菌的穩(wěn)定期持續(xù)約8 h。（四）衰亡期（decline phase）細菌開始大量死亡，死菌數(shù)超過活菌數(shù)。如不移植到新的培養(yǎng)基，最終可全部死亡。此期細菌的菌體變形或自溶，染色不典型，難以進行鑒定。細菌的生長曲線是在體外人工培養(yǎng)條件下觀察到的，在動物體內(nèi)因受諸多因素的制約，未必能出現(xiàn)此種典型的曲線，但對細菌的生長規(guī)律的研究及實踐有重要的參考價值。返回第三節(jié) 細菌的人工培養(yǎng)用人工方法，提供細菌在自然環(huán)境或動物體內(nèi)生長繁殖需要的基本條件，達到細菌培

17、養(yǎng)、鑒定及進一步利用的目的。人工培養(yǎng)細菌，除需提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)外，尚需有合適的酸堿度、適宜的溫度及必要的氣體環(huán)境。在營養(yǎng)豐富、生長繁殖條件適宜時，細菌生長繁殖最為迅速。一、細菌的營養(yǎng)需要細菌種類繁多，營養(yǎng)需要千差萬別，但其基本營養(yǎng)要求不外水分、無機鹽類、含碳化合物和含氮化合物，個別細菌還需要生長因子等特殊物質(zhì)。（一）水分水雖不屬于嚴格的營養(yǎng)物質(zhì)，但細菌生長繁殖需要大量的水分。水除是細菌的主要組成成分之一外，同時又是一種良好的溶劑，許多物質(zhì)溶解于水中才能被細菌吸收，細菌的滲透、分泌和排泄以及水解和許多生化反應(yīng)等作用都以水為媒介。另外，水的比熱大，利于熱的吸收和散發(fā)，可有效地調(diào)節(jié)細胞與所處環(huán)境的

18、溫度。（二）無機鹽類無機鹽類可提供細菌生長所需的一些元素，根據(jù)對其需要量可分為常量元素和微量元素。一般情況下，這些元素在所供給的水、營養(yǎng)物質(zhì)中含有，不需特殊提供。但有些細菌，如嗜鹽菌對Na和Cl有特殊需要（三）含碳化合物細菌合成碳水化合物，進一步合成多糖、脂類、蛋白質(zhì)、核酸等組成成分需要碳素營養(yǎng)，自養(yǎng)菌是以CO2或碳酸鹽為碳源，異養(yǎng)菌則以有機含碳化合物為碳源，也需要少量的CO2，可由分解代謝所產(chǎn)生的CO2滿足其需要。有些異養(yǎng)菌在培養(yǎng)開始時，需先加一些CO2以促進其生長。異養(yǎng)菌最常利用的碳源是糖類，另外還有有機酸、醇類、脂類以及氨基酸等。糖類以單糖(己糖)主要是葡萄糖和果糖，幾乎所有異養(yǎng)菌均可利

19、用；雙糖中的蔗糖、乳糖、麥芽糖等某些細菌可利用；多糖中的淀粉，病原菌往往可能利用，而纖維素、果膠等只能為某些自然界的細菌所利用。細菌能利用什么種類的糖類物質(zhì)或含碳物質(zhì)并產(chǎn)生什么樣的產(chǎn)物，這可作為細菌鑒定的依據(jù)。在培養(yǎng)細菌時，因細菌可利用氨基酸中的碳素，往往不需添加任何糖類。（四）含氮化合物有機的、無機的含氮化合物均可作為細菌氮源，但細菌種類不同而對氮源要求有所差異。有些細菌（如固氮菌）可利用空氣中的分子狀態(tài)的氮，而大多數(shù)細菌能利用無機的銨鹽、硝酸鹽以及有機的氨基酸。許多病原菌不能利用無機含氮化合物，需要供給有機含氮化合物才能生長。高分子的蛋白胨和蛋白質(zhì)，細菌不能直接利用，必須經(jīng)由細菌分泌的蛋白

20、水解酶降解為肽或氨基酸后才能利用。由于細菌種類不同，利用無機含氮化合物的能力不同，可作為細菌鑒定的依據(jù)。（五）生長因子除上述營養(yǎng)物外，有些細菌還需特殊的物質(zhì)才能生長或促進其生長，這類物質(zhì)稱為生長因子(growth factor)。生長因子多為維生素或維生素類似物，主要是B族維生素，還有對氨基苯甲酸和谷氨酰胺等，主要作為輔酶或輔基的成分而起作用。此外，還有一些化合物為某些細菌生長所必需，如嗜血桿菌生長需要血液中的X因子和V因子。X因子與氯化高鐵血紅蛋白相同，V因子是輔酶I(NAD)或輔酶II(NADP)。生長因子通常由酵母浸出物、血液、腹水或血清供給。對生長因子需要的不同，也可作為細菌鑒定的依據(jù)

21、。二、細菌生長繁殖的條件細菌要正常的生長繁殖，必須具備符合其生理特性的一定環(huán)境條件。（一）營養(yǎng)物質(zhì)根據(jù)細菌的營養(yǎng)需要，要滿足其生長所必需的水分、無機鹽、含碳化合物、含氮化合物以及生長因子等。所提供的營養(yǎng)物質(zhì)應(yīng)不含對細菌生長有害、有毒的成分。（二）溫度不同細菌對溫度有不同適應(yīng)范圍，各種細菌又有各自的可生長溫度范圍及最適溫度。根據(jù)細菌對溫度的適應(yīng)范圍，可將細菌分為三類：嗜冷菌（psychrophile），生長范圍-530，最適生長1020；嗜溫菌（mesophile），生長范圍1045，最適2040；嗜熱菌（termophile），生長范圍2595，最適5060。病原菌已適應(yīng)動物的體溫，因此均為嗜

22、溫菌。某些嗜冷菌對魚類等變溫動物有致病性。（三）酸堿度pH影響微生物的生長，每種細菌均有一個可適應(yīng)的pH范圍及最適生長pH。雖然大多數(shù)細菌在pH 68之間可以生長，但多數(shù)病原菌的最適pH為7.27.6，個別偏酸，如鼻疽假單胞菌（Pseudomonas mallei）為pH 6.46.6；或偏堿，如腸球菌（Enterococcus）為pH 9.6。在細菌生長過程中，能使培養(yǎng)基變酸或變堿而影響其生長，所以在培養(yǎng)基中往往需要加入一定的緩沖劑。（四）氧氣 根據(jù)細菌對氧的要求，可將其分為需氧菌、厭氧菌及兼性厭氧菌。需氧菌（aerobe）行需氧呼吸，必須在有一定濃度的游離氧的條件下才能生長繁殖，其中只需低

23、分子氧濃度(2%10%)者特稱微需氧菌(microaerophilic bacteria)。厭氧菌（anaerobe）行厭氧呼吸，必須在無游離氧或其濃度極低的條件下才能存活。其原因是，細菌在代謝過程中產(chǎn)生對菌體有毒性的過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O2）和羥自由基（OH·）等，厭氧菌部分或全部缺乏降解這些產(chǎn)物的酶，如過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等，因O2或H2O2的毒性作用死亡。兼性厭氧菌（facultative anaerobe）既可行需氧呼吸，又可行厭氧呼吸，通常在有氧條件比無氧環(huán)境生長更好。（五）滲透壓細菌生長有一定的可生長滲透壓范圍和最適滲透壓，大多數(shù)細菌生長最

24、適滲透壓為等滲環(huán)境，也有些細菌（如嗜鹽菌）適宜高滲環(huán)境。細菌一般較其他生物細胞對滲透壓的改變有較大的適應(yīng)能力。三、培養(yǎng)基（culture medium）培養(yǎng)基是人工配制的基質(zhì)，含有細菌生長繁殖必需的營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基制成后，通常都要經(jīng)滅菌處理。按營養(yǎng)組成的差異，可將培養(yǎng)基分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基（basal medium）及營養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrient medium）。前者含多數(shù)細菌生長繁殖所需的基本營養(yǎng)成分，常用新鮮牛肉浸膏，加入適量的蛋白胨、NaCl、磷酸鹽，調(diào)節(jié)pH至7.27.6即成。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，添加葡萄糖、血液或血清等，即為營養(yǎng)培養(yǎng)基，最常用的是血瓊脂平板。按狀態(tài)的差異，可將培養(yǎng)基分為固體培養(yǎng)

25、基、半固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)三類。液體培養(yǎng)基（liquid medium）即不加凝固劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或營養(yǎng)培養(yǎng)基，用于擴增純培養(yǎng)的菌體、確定細菌生長曲線等。在液體培養(yǎng)基中加入1%2%的瓊脂，即成為遇熱融化、冷卻后凝固的固體培養(yǎng)基（solid medium），用于細菌的分離、純化、生物活性檢測等。如將加入液體培養(yǎng)基的瓊脂減半，用0.5%左右，即成為半固體培養(yǎng)基（semi-solid medium），可作穿刺試驗，觀察細菌的動力及短期保藏菌種等。按功能的差異，可將培養(yǎng)基分為鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基及厭氧培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入特定作用底物及產(chǎn)生顯色反應(yīng)的指示劑，即可憑肉眼根據(jù)顏色識別，這就是鑒別培養(yǎng)基（d

26、ifferential medium）。在培養(yǎng)基中加入某種化學(xué)物質(zhì)，對不同細菌分別產(chǎn)生抑制或促進作用，從而可從混雜多種細菌的樣本分離出所需細菌，此即為選擇培養(yǎng)基（selective medium）。最常用的有麥康凱（MacConkey）培養(yǎng)基，內(nèi)含膽酸鹽，能抑制革蘭氏陽性菌的生長，有利于大腸桿菌及沙門氏菌的生長。在實際使用中，鑒別與選擇兩種功能往往結(jié)合在一種培養(yǎng)基之中。厭氧培養(yǎng)基（anaerobic medium）是為培養(yǎng)厭氧菌而設(shè)計的，是在培養(yǎng)基中加入還原劑如巰基乙酸鈉等，或用石蠟或凡士林封住培養(yǎng)基表面，隔絕空氣，有的還需放入無氧氣培養(yǎng)箱維持無氧環(huán)境。庖肉培養(yǎng)基（cooked meat me

27、dium）是常用的厭氧培養(yǎng)基，其中含不飽和脂肪酸和谷胱甘肽的肉渣起到還原劑的作用。返回第四節(jié) 病毒的增殖 病毒由于缺乏自身增殖所需的完整酶系統(tǒng)，增殖只能在活細胞內(nèi)進行，是以病毒基因組為膜板，在酶的作用下，分別合成其基因及蛋白質(zhì)，再組裝成完整的病毒顆粒。該過程不是簡單的核酸復(fù)制，也不同于細胞性生物的分裂，應(yīng)稱之為增殖。病毒的一步生長曲線(one-step growth curve)：感染比(multiplicity of infection，MOI)是指在一個系統(tǒng)中感染病毒的細胞數(shù)與細胞總數(shù)之比。在培養(yǎng)的細胞中，接種高MOI的病毒，使所有細胞幾乎同時受到病毒感染，如分析該培養(yǎng)系統(tǒng)中的單個細胞，就

28、可以代表病毒在整個體系中所有細胞的生長情況。應(yīng)用這一方法，可獲得病毒一步生長曲線試驗結(jié)果，觀察到病毒具有增殖周期(multiplication cycle)。一個完整的增殖周期包括吸附、侵入與脫殼、生物合成、組裝與釋放等步驟。因病毒不同其增殖周期長短不一，如小RNA病毒為2個多小時，皰疹病毒為10小時左右，腺病毒1425小時。隱蔽期(eclipse period)：從侵入細胞的病毒顆粒完全消失開始，到新的子代病毒顆粒出現(xiàn)為止，這階段稱為隱蔽期(晦暗期或隱晦期)。毒的增殖過程（一）、吸附病毒顆粒與易感細胞表面特異性受體牢固結(jié)合而附著在表面的過程叫吸附(adsorption)。吸附過程可分為靜電吸

29、附和特異性受體吸附兩個階段。靜電吸附:細胞及病毒顆粒表面都帶負電荷，Ca2、Mg2等陽離子能降低負電荷，促進靜電吸附。特異性吸附:是病毒表面的分子如囊膜纖突等吸附機構(gòu)與敏感細胞膜上的特異病毒受體呈互補性的結(jié)合，吸附牢固，不可逆。細胞表面的病毒特異性受體，從進化論的觀點察，是病毒長期適應(yīng)于細胞內(nèi)寄生的結(jié)果。也就是“受體”原為細胞成分，是病毒在適應(yīng)細胞內(nèi)寄生時逐漸具備了對細胞膜上某些成分的相應(yīng)結(jié)合機構(gòu)。因此，病毒與受體的特異性結(jié)合構(gòu)成了病毒對細胞的嗜性(cell tropism)。 (二)、侵入與脫殼侵入:目前發(fā)現(xiàn)動物病毒侵入細胞有3種方式：即（1）病毒直接轉(zhuǎn)入胞漿；（2）細胞吞飲病毒；（3）病毒

30、囊膜與細胞膜融合。無囊膜病毒以前二種方式侵入，有囊膜病毒常以第三種方式進入。1. 直接轉(zhuǎn)入：如小RNA病毒吸附宿主細胞后，由于結(jié)合力的影響，病毒衣殼發(fā)生微細的空間變化，失去VP4，并進入胞漿。2. 細胞吞飲：是吸附病毒的那一部分細胞膜與鄰近細胞膜部分之間出現(xiàn)電位差，ATP酶活化，致使細胞膜內(nèi)折，形成吞飲泡而將病毒向細胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移。3. 與細胞膜融合：當囊膜病毒的囊膜與細胞膜結(jié)合后，囊膜與細胞膜發(fā)生融合，裸露出核衣殼而直接進入細胞漿。侵入的幾種方式脫殼:病毒脫殼包括脫囊膜和脫衣殼兩個過程。有囊膜的病毒主要在侵入的過程脫囊膜，沒有囊膜的病毒則只有脫衣殼的過程。1. 脫囊膜：2. 脫衣殼：脫殼（三）、

31、生物合成病毒的生物合成(biosynthesis)發(fā)生在隱蔽期，包括mRNA的轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)及DNA或RNA的合成等。此期是病毒增殖的最主要階段，病毒的遺傳信息向細胞傳達，細胞在病毒遺傳信息的控制下合成病毒各種組成成分及其所需的酶類，包括病毒核酸轉(zhuǎn)錄或復(fù)制時所需的聚合酶。病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制方式（遺傳機制）:病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制是增殖過程的關(guān)鍵步驟。DNA病毒特別是雙股DNA病毒的增殖機制與真核細胞有相似之處，但RNA病毒則差別較大。正單股RNA病毒，其基因組本身即可作為mRNA，負單股或雙股RNA病毒則必須攜帶依賴于RNA的RNA聚合酶，以供轉(zhuǎn)錄mRNA。病毒的增殖過程雖千差萬別，但其基因

32、組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制途徑有一定的相似性。1978年Baltimore建議以mRNA（正股）為中心，將病毒的遺傳機制分為6個基本類型，此后發(fā)展為7種(見圖30-6)。IVRNA (副黏病毒、正黏病毒、彈狀病毒、絲狀病毒、布尼病毒、波納病毒、砂粒病毒)mRNA±RNA(呼腸孤病毒、雙RNA病毒)RNA(冠狀病毒、微RNA病毒、披膜病毒、黃病毒、動脈炎病毒)DNA(細小病毒、圓環(huán)病毒)RNA(反錄病毒)DNA±DNA(痘病毒、多瘤病毒、乳頭瘤病毒、腺病毒、皰疹病毒)±DNA(嗜肝病毒)VIIIII圖 動物病毒轉(zhuǎn)錄mRNA的基本模式無囊膜的DNA病毒合成過程無囊膜的RNA病毒合

33、成過程有囊膜的DNA病毒合成過程(四)、組裝與釋放組裝:新合成的病毒核酸和病毒蛋白質(zhì)在感染細胞內(nèi)組合成病毒顆粒的過程，叫組裝。釋放: 病毒顆粒逸到宿主細胞外的過程叫釋放。病毒不同其釋放形式各異，可歸納為以下4種釋放方式。1. 爆破式 2. 出芽式3. 排泄式 4. 轉(zhuǎn)移式 釋放裝配二、病毒的細胞培養(yǎng)病毒的嚴格細胞內(nèi)寄生性決定培養(yǎng)病毒必須使用活細胞，實驗動物、雞胚和細胞培養(yǎng)可提供病毒增殖所需的大量活細胞，尤其是細胞培養(yǎng)。（一）、細胞培養(yǎng)的特點利用細胞培養(yǎng)來增殖病毒具有以下特點：1. 細胞培養(yǎng)中的每個細胞具有基本一致的生理特性，對病毒的易感性相同，沒有實驗動物的個體差異。2. 可用于試驗的數(shù)量遠遠

34、超過動物或雞胚，并且易于人工控制，可在無菌條件下進行標準化的試驗，重復(fù)性好。3. 病毒增殖可通過觀察細胞產(chǎn)生的變化如細胞病變等來判定結(jié)果，也可結(jié)合免疫學(xué)技術(shù)檢測細胞內(nèi)有無增殖的病毒。4. 用細胞培養(yǎng)可從感染動物組織內(nèi)分離病毒并進行病毒克隆，以分離獲得純化的單一毒株。（二）、細胞培養(yǎng)的類型1. 原代細胞(primary cell)2. 二倍體細胞株(diploid cell strain)3. 傳代細胞系(established cell line)正常細胞（三）、細胞培養(yǎng)的方法1. 靜置培養(yǎng)(stationary culture)2. 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)(roller culture) 3. 懸浮培養(yǎng)(suspensive culture)4. 微載體培養(yǎng)(micro-carrier culture)轉(zhuǎn)式細胞培養(yǎng)器貼壁式細胞培養(yǎng)器旋培四、病毒與細胞的相互作用病毒的種類千差萬別，其宿主細胞種類也多達200多種，病毒與宿主細胞之間作用的表現(xiàn)形式各異。目前對病毒與細胞的相互作用研究，還是以細胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的病毒所致的細胞、亞細胞及分子水平的變化為主。（一）、病毒與細胞相互作用的類型1. 殺細胞