實驗一硫酸苯酚法測多糖含量

1、實硫酸-苯酚法測多糖含量1. 目的要求2. 測量意酮硫酸法不能測量的血清型的過程樣品中的多糖含量3. 2.方法原理4. 糖在濃硫酸作用下，水解生成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚縮合成橙黃色化合物，且顏色穩(wěn)定，在波長490 nm處和一定的濃度范圍內，其吸光度與多糖含量呈線性關系正比，從而可以利用分光度計測 定其吸光度，并利用標準曲線定量測定樣品的多糖含量， 本方法可用于多糖、 單糖含量的測定。5. 3.主要實驗儀器及材料6. 濃硫酸，苯酚，蒸儲裝置，分光光度計，電子天平，坐標紙或電腦等。1.4. 掌握要點8. 硫酸顯色的安全、準確操作，單糖到多糖的轉換系數。9. 5 .試劑配制10.

2、 1）葡萄糖標準液的配制11. 準確稱取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸儲水準確定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，搖勻后準確吸取10 mL該溶液，蒸儲水稀釋定容至100 mL, 即得100 ug/mL的葡萄糖標準液。12. 2） 90%苯酚液的配制13. 準確移取苯酚90mL,蒸儲水定容至100 mL,即得90%苯酚液，棕色 瓶中避光保存3） 6%苯酚液的配制將90%苯酚液稀釋至6%,即一體積儲存液對應十四體積純水，臨用現配6.實驗步驟表1標準曲線的制作步驟7.管號8.葡萄糖0.00.10.20.30.40.60.81.09.苯酚液0.50.50.50.50.50.50.50.510

3、.濃硫酸3.03.03.03.03.03.03.03.011. 取8支干凈的具塞試管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入 0.5ml的苯酚溶液，震蕩搖勻后緩慢逐滴加入純硫酸，以不放熱或微量放熱為宜， 搖勻后恒溫加塞沸水放置20min,取出涼水冷卻10min,以0號作為空白調零， 在最大吸收波長處（490nm）測定吸光度。以葡萄糖濃度X為橫坐標（ug/mL）, 吸光度Y為縱坐標，從而來繪制標準曲線。用 exceL軟件求得回歸方程 12.2）待測樣品多糖的測定與計算13.將提取得到的待測多糖用蒸儲水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按標準曲線中的測定方法，以樣液為參比液，測定溶液的吸光值，按

4、回歸方 程計算待測溶液的多糖濃度，注意乘換算系數。二、實驗原理游離的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在濃硫酸的作用下脫 水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物與慈酮縮合成藍色的化合物， 在620nm處有 最大吸收，在一定糖濃度范圍內（200ug/ml）,溶液吸光度值與糖溶液的濃 度成線性關系。用酸將植物組織中沒有還原性的多糖和寡糖徹底水解成具有 還原性的單糖，或直接提取植物組織中的還原糖，即可對植物組織中的總糖 和還原糖進行定量測定。三、實驗材料1 .可見分光光度計、電子天平（1/100）、粉碎機、水浴鍋、電爐。研缽、 量筒、三角燒瓶、燒杯、容量瓶、玻璃漏斗、試管1.5cmx 15cm、刻度吸管、

5、 膠頭滴管、pH試紙、坐標紙。四、實驗試劑1 .慈酮試劑：取2g慈酮溶于1000ml體積分數為80%的硫酸中，當日配 制使用。2 .標準葡萄糖溶液（0.1mg-m1）:稱取100mg葡萄糖，溶于蒸儲水并稀釋 至1 000ml （可滴加幾滴甲苯作防腐劑）。3 . 6mo1-L HC1 溶液：50ml 鹽酸，加水至 100ml4 . 10%NaOH溶液：稱取10g NaOH固體，溶于蒸儲水并稀釋至100ml。五、操作步驟1 .葡萄糖標準曲線的繪制取干凈試管6支，按下表進行操作。以吸光度為縱坐標各標準液濃度（mg-m1） 為橫坐標做圖。2 .樣品中還原糖的提取和測定稱取植物原料干粉0.10.5g,加

6、水約3ml,在研缽中磨成勻漿，轉入三 角燒瓶中，并用約30ml的蒸儲水沖洗研缽23次，洗出液也轉入三角燒瓶 中。于50c水浴中保溫半小時（使還原糖浸出），取出，冷卻后定容至100ml。 過濾，取lml濾液進行還原糖的測定：吸取lml總糖類溶液置試管中，浸于 冰浴中冷卻，再加入4ml慈酮試劑，沸水浴中準確加熱10min,取出用自來 水冷卻后比色，其他條件與做標準曲線相同，測得的吸光度值由標準曲線查 算出樣品液的糖含量。（樣品液顯色后若顏色很深，其吸光度超過標準曲線 濃度范圍，則應將樣品提取液適當稀釋后再加慈酮顯色測定）。標準曲線的制作及樣品測定參考表1# 2# 3# 4# 5#6#7# （樣品）

7、8# （樣品）標準葡萄糖溶液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 還原糖 總糖蒸儲水（ml）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0樣品液（ml）- 1.01.0糖溶液濃度（mg/ml） 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 待測 待測置冰水浴中冷卻慈酮試劑J （ml）4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.04.0沸水浴中準確加熱10min,取出，用自來水冷卻，室溫放置 10minA620nm3 .樣品中總糖的提取、水解和測定稱取植物原料干粉0.10.5g,加水約3ml,在研缽中磨成勻漿，轉入三角燒 瓶中，并用約12ml的蒸儲水沖洗研缽23次，洗

8、出液也轉入三角燒瓶中。 再向三角燒瓶中加入6mol/L鹽酸10ml,攪拌均勻后在沸水浴中水解半小時， 冷卻后用10% NaOH溶液中和pH呈中性。然后用蒸儲水定容至100ml,過 濾，取濾液10ml,用蒸儲水定容100ml,成稀釋1000倍的總糖水解液。取 lml總糖水解液，測定其還原糖的含量：吸取 lml總糖類溶液置試管中，浸 于冰浴中冷卻，再加入4ml慈酮試劑，沸水浴中準確加熱10min,取出用自 來水冷卻后比色，其他條件與做標準曲線相同，測得的吸光度值由標準曲線 查算出樣品液的糖含量。六、實驗結果按照下列公式分別計算植物原料干粉中還原糖和總糖的質量分數（3）。3 （還原糖）(C1V1/m) x 100%3 (總糖)=(C2V2/m) x 0.9x 100%式中（還原糖）：還原糖的質量分數（）;（總糖）：總糖的質量分數（%）；C1:還原糖的質量濃度（mg/ml）;C2:水解后還原糖的質量濃度（mg/ml）;V1 :樣品中還原糖提取液的體積（ml）;V2:樣品中總糖提取液的體積（ml）;m :樣品質量（mg）。注：計算總糖含量的公式，在測定干擾雜質很少、還原糖含量相對總糖含量很少時適用，乘0.9是為了從測定出的總糖水解成的單糖量中，扣除水解 時所消耗的水量。七、注意事項1 .總糖：食品中的總糖通常是指具有還原性的糖 （葡萄糖,果糖,乳糖,麥芽糖 等）