抗菌肽cecropin-Xm在大腸埃希菌中的串聯(lián)表達與抑瘤作用

1、抗菌肽cecropin-Xm在大腸埃希菌中的串聯(lián)表達與抑瘤作用                     作者：沈益 勞學(xué)剛 耿偉 張洪祖 徐賢秀【摘要】   在TNF基因3端連接抗菌肽cecropin-Xm基因多拷貝串聯(lián)體，與溫度誘導(dǎo)的表達載體pRCs組成表達載體pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)，并在大腸埃希菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達融合蛋白TNF-(

2、cecropin-Xm)n(n=1，2，3)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在同樣表達條件下 應(yīng)用 BL21(DE3)/pRCs-TNF-(cecropin-Xm)2表達系統(tǒng)可獲得比BL21(DE3)/pRCs-TNF-cecropin-Xm系統(tǒng)多出一倍的目的物cecropin-Xm。融合蛋白經(jīng)CNBr切割后用CM52纖維素柱分離純化得到純度大于95%的具有抑菌活性的抗菌肽cecropin-Xm，體外MTT抑瘤實驗表明cecropin-Xm具有廣譜殺滅腫瘤細胞的作用并且對正常細胞影響極小。 【關(guān)鍵詞】   抗菌肽； Cecropin-Xm； 基因串聯(lián)； 抑瘤作用  &

3、#160;  抗菌肽cecropins是瑞典 科學(xué) 家Boman于1980年首先從惜古比天蠶中發(fā)現(xiàn)的1，后來在其它蠶類、昆蟲和哺乳動物2，3中發(fā)現(xiàn)了各種類型的抗菌肽，其中包括多種cecropin類的抗菌肽?？咕腸ecropins一般由3339個氨基酸組成，具有高度的同源性，對革蘭陽性菌和陰性菌都有殺傷力，對正常真核細胞沒有影響4。有實驗表明，抗菌肽的作用對象和作用機制各異，其中某些抗菌肽可以通過引起腫瘤細胞凋亡5和激活經(jīng)典的補體途徑等來殺傷腫瘤細胞6。    為了更好的研究cecropin類的抗菌肽，本實驗室參照抗菌肽CMIV7的氨基酸序列，用化學(xué)方法

4、合成了編碼抗菌肽CMIV突變體cecropin-X的cDNA8，并在大腸埃希菌中進行表達研究9。為了獲得易于后期純化且穩(wěn)定的表達系統(tǒng)，在pRC系統(tǒng)10中完成了抗菌肽cecropin-X基因與TNF(天然型腫瘤壞死因子)的融合表達11。為了從源頭上提高抗菌肽的產(chǎn)量，首先利用PCR方法在cecropin-X基因末端加入了甲硫氨酸的密碼子， 得到了cecropin-Xm基因； 再將cecropin-Xm基因串聯(lián)在TNF基因的3-端。在此基礎(chǔ)上，完成了TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的串聯(lián)表達，純化得到了與cecropin-X具有同樣抑菌活力的高純度的cecropin-Xm。在體

5、外實驗中，cecropin-Xm對多種人源腫瘤細胞表現(xiàn)出明顯的抑制作用。    1  材料和方法    1.1  材料    1.2  方法    (1)取質(zhì)粒pRC用EcoRI和PstI酶切后回收；(2)合成互補的寡核苷酸鏈  5-AATTCGTCGACGGATCCCTGCA-3和5-GGGATCCGTCGACG-3，加入T4 DNA連接緩沖液，85加熱5min后 自然 冷卻至室溫；(3)將(1)和(2)的產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化入E.coli

6、 TOP10感受態(tài)細胞中，涂布LB(含氨芐西林100g/ml，如無特殊說明以下同)平板，30培養(yǎng)過夜；(4)對隨機挑選的5個克隆進行測序鑒定。    (1)取本實驗室構(gòu)建的質(zhì)粒pRC-TNF-(cecropin-X)11，用EcoRI、SalI酶切并回收TNF片段；(2)質(zhì)粒pRC-TNF-(cecropin-X)為模板，寡核苷酸鏈，5-CGGTCGACATGAGATGGAAAATC-3為5端引物，分別以寡核苷酸鏈，5-CCGGATCCACTACATGTTGATGGTAGCAGC-3和，5-CGGTCGACCATGTTGATGGTAGCAGC-3為3端引物，利用P

7、CR擴增11獲得末端加入甲硫氨酸密碼子(ATG)和終止密碼子(TAG)的cecropin-Xm基因片段Xm-a，以及末端僅含甲硫氨酸密碼子(ATG)的cecropin-Xm基因片段Xm-b，回收相應(yīng)片段；(3)分別用EcoRI和BamHI酶切質(zhì)粒pRCs；SalI和BamHI酶切Xm-a；SalI酶切Xm-b，回收pRCs、Xm-a和Xm-b；(4)將上述(1)和(3)產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化入E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中，涂布LB平板，30培養(yǎng)過夜；(5)挑選單克隆后提取質(zhì)粒，用EcoRI和PstI酶切后行1%瓊脂糖電泳檢查。將有特異性片段的克隆進行測序鑒定。  &

8、#160; 細胞增殖抑制率(%)=(1-實驗組A均數(shù)   對照組A均數(shù))×100%    2  結(jié)果    2.1  抗菌肽cecropin-Xm基因與表達載體pRCs的獲得及重組質(zhì)粒pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的構(gòu)建    (1)將質(zhì)粒pRC-TNF-(cecropin-X)11用EcoRI、SalI完全酶切，回收TNF片段(490bp)，即得到含起始密碼子但不含終止密碼子的兩端分別帶EcoRI、SalI酶切位點的TN

9、F片段。將此片段與上述得到的載體pRCs(經(jīng)EcoRI、SalI酶切后回收)連接即得到質(zhì)粒pRCs-TNF(3945bp)。    2.2  重組蛋白的表達    含不同cecropin-X基因數(shù)的重組質(zhì)粒pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1，2，3)的大腸埃希菌經(jīng)溫度誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE檢測結(jié)果(Fig.3)表明，當n    pRC-T-X: pRC-TNF-cecropin-X;  pRCs-T: pRCs-TNF;    pR

10、Cs-T-Xm2: pRCs-TNF-(cecropin-Xm)2    Fig.1    Construction of pRCs-TNF-(cecropin-Xm)2    M: SE Perfect 100bp DNA ladder;  0: pRCs;    13: pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)    Fig.2    Electrophoresis of pRC

11、s and pRCs-TNF-    (cecropin Xm)n (n=1,2,3) cleaved with    restriction enzymes EcoRI 和PstI    值為1，2，3時，誘導(dǎo)表達的融合蛋白的分子量相應(yīng)為21000、26000和31000ku左右(Fig.3中分別用黑色箭頭表示)，F(xiàn)ig.3結(jié)果顯示含有2個cecropin-Xm基因的重組質(zhì)粒融合蛋白表達量比只有單個基因的略高，但含有3個cecropin-Xm基因的重組質(zhì)粒融合蛋白表達量則明顯減少。  

12、;  2.3  Cecropin-Xm的純度鑒定和抑菌活性比較    46: BL21(DE3)/pRCs-TNF-(cecropin-Xm)n (n=1,2,3)    Fig.3    Expression of TNF-(cecropin-Xm)n (n=1,2,3)    in E.coli BL21(DE3)    3800ku，用RP-HPLC檢測純度可達95%以上。    2.4&#

13、160; Cecropin-Xm的抑瘤活性    Cecropin-Xm純化樣品檢測了對腫瘤細胞HepG2、QGY-7703、Hela、BGC-823、LOVO、U937、HL60和正常肝細胞HL-7702的IC50分別為100、6.30、10、160、15、10和>400gmol/L，結(jié)果表明cecropin-Xm對我們目前所研究的腫瘤細胞都表現(xiàn)出不同程度的殺傷力，尤其對QGY-7703、BGC-823、U937和HL60細胞的活性作用更明顯，而對正常肝細胞HL-7702不敏感。這就為將cecropin-Xm開發(fā)成為一種安全有效的抗腫瘤藥物提供了初步的實驗

14、。    3  討論    因為抗菌肽不僅殺菌還有抗病毒和抗腫瘤細胞而不破壞人體正常細胞等作用，因此正在 農(nóng)業(yè) 、畜牧業(yè)、醫(yī)藥及食品 工業(yè) 中顯示出越來越廣闊的 應(yīng)用 前景。通常研制和應(yīng)用的抗菌肽均是從昆蟲體液等天然物質(zhì)中提取，來源途徑廣泛，但含量極低，提取步驟繁雜，很難獲得大量高純度的抗菌肽。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，人們開始采用酵母體系及昆蟲或昆蟲細胞體系進行基因表達。從工業(yè)化生產(chǎn)的角度考慮，在基因工程表達體系中，具有成本低、周期短、表達水平高、易于操作等優(yōu)點的大腸埃希菌最理想。因此，相關(guān)研究單位對在大腸埃希菌中表達

15、抗菌肽進行了各種嘗試。本小組在完成了cecropin-X基因的克隆表達后，為了減少融合表達引起的目的蛋白的低含量，從源頭上提高目的蛋白的收率，采用了構(gòu)建多拷貝串聯(lián)體的方法，以期獲得更高表達量的目的蛋白。結(jié)果顯示只有2個cecropin-Xm基因串聯(lián)的重組質(zhì)粒融合蛋白表達含量比只有單個cecropin-Xm基因的略高，含有3個cecropin-Xm基因串聯(lián)的重組質(zhì)粒融合蛋白含量則明顯減少。我們還嘗試了4個cecropin-Xm基因串聯(lián)的重組質(zhì)粒，但在SDS-PAGE檢測時基本無特異性蛋白條帶的出現(xiàn)?？咕谋旧硭呢S富的正電荷可能是TNF-多個(cecropin-Xm)基因串聯(lián)(當n3時)融合蛋

16、白低水平表達的主要原因13。Cecropin-Xm是帶高度正電荷的肽，在宿主中表達時，n值越大它和核酸的結(jié)合機會越大，抑制了轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終導(dǎo)致低水平表達。因此，進一步的 工作 是尋找一種合適的方法消除這些正電荷的影響，如融合一段酸性肽使之以中性前體形式表達等。    為了保證純化過程中串聯(lián)體分離效率，我們?nèi)圆捎肅NBr切割，在串聯(lián)體間引入甲硫氨酸密碼子(ATG)。有 文獻 報道14，抗菌肽末端的甲硫氨酸經(jīng)CNBr作用后轉(zhuǎn)變成高絲氨酸(homoserine)，但不影響抗菌肽的生物活性。本實驗證明cecropin-Xm與cecropin-X的抗大腸埃希菌E.coli

17、 K12D31活性基本相同。本研究結(jié)果還表明cecropin-Xm對多種人源腫瘤細胞有較明顯的不同程度的殺傷作用，但對正常人胚肝細胞影響極小，進一步提示抗菌肽cecropin-Xm可能作為一種廣譜的低毒副作用的抗腫瘤藥物應(yīng)用于 臨床 ?！?參考 文獻】   1 St EI ner H, Hultmark D, Engstrom A, et al. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity J. Nature,1981,292:246.2 Boman H G. H

18、ultmark D Cell-free immunity in insects J. Annu Rev Microbiol,1987,41:103.3 Lee J Y, Boman I A, Sun C, et al. Antibacterial peptides from pig intestine: Isolation of a mammalian cecropin J. Proc Natl Acad Sci,1989,86:9159.4 Boman H G, Wade D, Boman I A, et al. Antibacterial and antimalarial properti

19、es of peptides that are cecropin-melittin hybrids J. FEBS Lett,1989,259:103.5 Gamen S, Hanson D A, Kaspar A, et al. Granulysin-induced apoptosis I. Involvement of at least two distinct pathways J. J Immunol,1998,161:1758.6 Chen J G, Xu X M, Underhill C B, et al. Tachyplesin activates the classic complement pathway to kill tumor cells J. Can Res,2005,65(11):4614.7 屈賢銘，吳克佐，邱雪貞，等. 經(jīng)聚肌胞苷酸誘導(dǎo)家蠶蛹血淋巴中六種抗菌肽的分離與鑒定J. 生物化學(xué)與生物物 理學(xué) 報，1986，18(3)：284.8 謝維，邱奇峰，陳江寧，等. 中國 家蠶抗菌肽CMIV基因的化學(xué)合成與克隆J. 南京大學(xué)學(xué)報( 自然 科學(xué) 版)，1996，32(3)：474.9 謝維，竇非，吳海宏，等. 抗菌肽CMIV突變體基因在E.coli中融合表達的研究J. 中國科學(xué)C輯，1997，27(3)：278.10 陳建軍，孫苗，陳常慶，等.