實驗二動物蠕蟲學糞便檢查技術(二)VIP

1、實驗二 動物蠕蟲學糞便檢查技術(二)一、實驗目的及要求1、掌握動物蠕蟲學常見的實驗室糞便幼蟲培養(yǎng)及檢查技術。2、認識線蟲幼蟲和吸蟲毛蚴等寄生蟲幼蟲的一般形態(tài)特征。二、實驗器材載玻片，蓋玻片，平皿，培氏皿，鑷子，燒杯，塑料杯，塑料袋，漏斗，漏斗架，膠帽吸管，離心管，試管，玻璃棒，紗布，脫脂棉，糞篩，錦綸篩（260目/英寸），搪瓷缸，三角量筒，三角燒杯，膠塞，表玻璃，酒精燈，平底孵化瓶，貝爾曼氏裝置（乳膠管二端分別連接漏斗和小試管），顯微鏡測微器（目鏡測微尺、物鏡測微尺），血球計數(shù)板，普通溫箱，光學顯微鏡等。碘液，家畜新鮮糞便等。三、實驗方法、步驟和操作要領（幼蟲培養(yǎng)法、毛蚴孵化法、幼蟲分離法、寄

2、生蟲學測微法）（一）幼蟲培養(yǎng)法（Technique for the Culture of Third-stage Larvae）圓線目中有很多線蟲的蟲卵在形態(tài)結構上非常相似，、難以進行鑒別。有時為了進行科學研究或達到確切診斷目的，可進行第三期幼蟲的培養(yǎng)，之后再根據(jù)這些幼蟲的形態(tài)特征進行種類的判定。另外，做人工寄生性線蟲感染試驗時，也要用到幼蟲培養(yǎng)技術。 (圖2-1)幼蟲培養(yǎng)的方法很多，這里僅介紹最簡單的一種。即：取新鮮糞便若干，弄碎置培養(yǎng)皿中央堆成半球狀，頂部略高出，然后在培氏皿內(nèi)邊緣加水少許（如糞便稀可不必加水），加蓋蓋好使糞與培氏皿接觸。放入2530的溫箱內(nèi)培養(yǎng)（夏天放置室內(nèi)亦可）。每日觀

3、察糞便是否干燥，要保持適宜的濕度。約經(jīng)715天，第三期幼蟲即可出現(xiàn)（Egg-L1-L2-L3），它們從糞便中出來，爬到培氏皿的蓋上或四周。這時，我們可用膠帽吸管吸上生理鹽水把幼蟲沖洗下來，滴在載玻片上覆以蓋片，在顯微鏡下進行觀察。圖2-1 馬屬動物圓線蟲第三期幼蟲1. 馬圓線蟲 2. 普通圓線蟲 3.無齒圓線蟲 4.小型圓線蟲培養(yǎng)幼蟲時如無培氏皿，可用一大一小二個平皿來代替，將小平皿（去掉蓋）加上糞便放于大平皿中央，大平皿內(nèi)加少許水，然后用大平皿蓋蓋上，即可進行培養(yǎng)。也可用兩個塑料杯來培養(yǎng)幼蟲，效果更好。即先將一個塑料杯（上大下小）一截為二，較小的底部用針扎許多小孔，裝滿待培養(yǎng)糞便，上用雙層紗

4、布蒙上，再把截下的那部分套上（頭向下），使紗布繃緊；然后在另一個塑料杯內(nèi)加少量水，把需培養(yǎng)的糞便杯套在該杯上（紗布面朝下），外面套上塑料袋進行培養(yǎng)即可。培養(yǎng)好后，用幼蟲分離法分離幼蟲。即把裝糞便的小杯放在分離裝置的漏斗上（用三角量筒也可），同時把塑料杯內(nèi)的水也倒入（用水沖洗幾次）。注意在放培養(yǎng)物時務必小心，不要使糞便散開。（二）毛蚴孵化法（Miracidum Hatching Method）毛蚴孵化法是專門用來診斷血吸蟲病的，其原理是將含有血吸蟲卵的糞便在適宜的溫度條件下，進行孵化，等毛蚴從蟲卵內(nèi)孵出來后，借著蚴蟲向上、向光、向清的特性，進行觀察，做出診斷。方法有多種，如常規(guī)沉淀孵化法、棉析毛

5、蚴孵化法、濕育孵化法、塑料杯頂管孵化法、尼綸篩網(wǎng)集卵孵化法等，這里只介紹其中兩種方法。(圖2-2) 圖2-2 塑料杯頂管裝置及尼綸篩網(wǎng)示意圖 1常規(guī)沉孵法（又稱沉淀孵化法或沉孵法）。 取糞便100g，放入搪瓷缸內(nèi)搗碎。加水約500 ml，攪拌均勻，通過糞篩濾入另一個容器內(nèi)，加水至九成滿，靜置沉淀，之后將上清液倒掉 ，再加清水攪勻，沉淀。如此反復34次。第一次沉淀時間約為30分鐘左右，以后20分鐘即可。最后將上述反復淘洗后的沉淀材料加30的溫水置于三角燒杯中，瓶口用中央插有玻璃管的膠塞塞上（或用搪瓷杯加硬紙片蓋上倒插試管的辦法）。杯內(nèi)的水量以至杯口2cm 處為宜，且使玻璃管或試管中必須有一段露出

6、的水柱，之后放入2530的溫箱中孵化。半小時后開始觀察水柱內(nèi)是否有毛蚴；如沒有，以后每隔1小時觀察一次，共觀察數(shù)次。任何一次發(fā)現(xiàn)毛蚴，即可停止觀察。(圖2-3)圖2-3 沉孵法裝置示意圖(引自Yang, 2005)毛蚴似針尖大小的白色蟲體，在水面下方4cm 以內(nèi)的水中作快速平行直線運動，或沿管壁繞行?？梢蓵r，可用膠帽吸管吸出在顯微鏡下觀察。有時混有纖毛蟲，其色彩也為白色，須加以區(qū)別。小型纖毛蟲呈不規(guī)則螺旋形運動或短距離搖擺；大型纖毛蟲（體大、呈透明的片狀）呈波浪式或翻轉運動。(圖2-4)A B C 圖2-4 血吸蟲蟲卵及毛蚴A.東畢吸蟲蟲卵 B. 日本血吸蟲蟲卵 C. 日本血吸蟲毛蚴1.原腸

7、2.頭腺 3.側穿入腺管 4.煙細胞 5.神經(jīng)結 6.腸細胞 7.纖毛 8.排泄孔也可用錦綸篩（篩絹孔徑為260目/英寸）集卵的辦法來取代上述的反復水洗沉淀過程，對洗后所剩的糞渣再進行孵化。12342.棉析毛蚴孵化法（簡稱棉析法）。 取糞便50g，經(jīng)反復淘洗或錦綸篩淘洗后（不淘洗也可），將糞渣移入300ml的平底孵化瓶中，灌注25的清水至瓶頸下部，在液面上方塞一薄層脫脂棉，大小以塞住瓶頸下部不浮動為宜，再緩慢加入20清水至瓶口13mm處。如棉層上面水中有糞便浮動，可將這部分水吸去再加清水。然后進行孵化。(圖2-5)圖2-5 棉析法裝置示意圖1.水平面 2.棉花 3.濁水層 4.糞渣這種方法的優(yōu)

8、點是糞便只需略微淘洗或不淘洗就可裝瓶孵化，毛蚴出現(xiàn)后可集中在棉花上層有限的清水水域中，可和下層混濁的糞液隔開，因而便于毛蚴的觀察。（三）幼蟲分離法（Baermann's Technique）本法又稱為貝爾曼氏法。主要用于生前診斷一些肺線蟲病。即從糞便中分離肺線蟲的幼蟲，建立生前診斷。也可用于從糞便培養(yǎng)物中分離第三期幼蟲或從被剖檢畜禽的某些組織中分離幼蟲。(圖2-6)圖2-6 貝爾曼氏幼蟲分離裝置示意圖操作方法：用貝爾曼氏裝置進行。即用一根乳膠管二端分別連接漏斗和小試管，然后置漏斗架上，通過漏斗加入40的溫水，水量約達到漏斗中部。之后漏斗內(nèi)放上置有被檢材料的糞篩。靜置1小時后，拿下小試管

9、，吸棄掉上清液，吸取管底沉淀物，進行鏡檢。 也可以用簡單的平皿法來分離幼蟲；即取糞球310個，置于放有少量熱水（不超過40）的表玻璃或平皿、培氏皿內(nèi)，經(jīng)1015分鐘后，取出糞球，吸取皿內(nèi)的液體，在顯微鏡下檢查幼蟲。（四）寄生蟲學測微法（Micrometry in Parasitology）圖2-7 顯微鏡測微器構造示意圖 顯微鏡測微器是在光學顯微鏡下測量細菌、細胞、寄生蟲卵、幼蟲、某些成蟲、原蟲等大小的儀器。它由二件組成：一是目鏡測微尺，一是物鏡測微尺。目鏡測微尺為一圓形小玻璃片，使用時裝在目鏡里。它的中央刻有100等分的小格，每5個和10個小格之間有一稍長線或長線相隔。這些小格在鏡下并沒有絕

10、對長度的意義，是隨著目鏡和物鏡倍數(shù)的不同和鏡筒的長短而變化的。因此，在測量前須用物鏡測微尺在各種不同放大倍數(shù)的目鏡和物鏡的搭配下測出目鏡測微尺每一刻度的絕對值。物鏡測微尺為一個特制的載玻片，其中央有一黑圈（或是一個圓玻璃片，上有黑圈），在圈的中間有一長為1mm橫線，被平均分成100格，每5格和10格之間有一稍長線或長線相隔。每格為0.01mm或10，這是絕對長度。(圖2-7)。使用時，將目鏡測微尺放于接目鏡內(nèi)，物鏡測微尺放在載物臺上。然后用低倍鏡調(diào)節(jié)焦距，使目鏡測微尺和物鏡測微尺的零點對齊，再尋找目鏡測微尺和物鏡測微尺較遠端的另一重合線，算出目鏡測微尺的幾格相當于物鏡測微尺的幾格，從而計算出目

11、鏡測微尺上每格的長度，以后測量時，只用目鏡測微尺量度就可以了。為了便于計算，可將目鏡測微尺在固定顯微鏡和固定倍數(shù)物鏡下的09格的長度事先計算好，列于卡片上，具體測量時，一查便知。在沒有物鏡測微尺時，可以用血球計數(shù)板代替使用。以該板內(nèi)1個小方格的長度為標準，即可按上述方法測出目鏡測微尺每1格的微米數(shù)。用目鏡測微尺測量蟲卵大小時，一般是測量蟲卵的最長和最寬處，圓形蟲卵則是測量直徑；測量幼蟲和某些成蟲時，是測量蟲體的長度、寬度及各部構造的尺寸大?。幌x體彎曲時，可通過旋轉目鏡測微尺的辦法，來進行分段測量，最后將數(shù)據(jù)加起來即可。(圖2-8)圖2-8 測微尺測量蟲卵示意圖（引自Thienpont et a

12、l, 1986）四、實驗注意事項1幼蟲培養(yǎng)法。如果是為了研究某種蠕蟲卵或幼蟲的生物學特性，那就必須先將患畜糞便用蠕蟲卵檢查法或蠕蟲幼蟲檢查法加以處理，然后將同種的蟲卵或幼蟲搜集在一起，放于培氏皿內(nèi)，在2530的溫箱中進行培育。培氏皿內(nèi)須預先放好培養(yǎng)基。對于吸蟲卵、絳蟲卵、棘頭蟲卵和大多數(shù)線蟲卵，可用水或生理鹽水做培養(yǎng)基。最好的培養(yǎng)基是滅菌的糞便或糞汁，尤以后者為佳。因為用糞汁培育蟲卵或幼蟲時，可以直接將培育有蟲卵或幼蟲的平皿放于顯微鏡下，觀察蟲卵或幼蟲的發(fā)育情況。糞便和糞汁的滅菌方法是100的溫度下煮沸兩小時。糞汁接種蟲卵或幼蟲之前，須先用棉絮過濾。2毛蚴孵化法。被檢糞便務必新鮮，不可觸地污染

13、；洗糞容器不宜過小，免得增加換水次數(shù)，影響毛蚴早期孵出；換水時要一次倒完，避免沉淀物翻動。如有翻動，須等沉淀后再換水；孵化用水一定要清潔，自來水須放置過夜脫氯后使用，所有與糞便接觸過的用具，須清洗后再沸水燙泡，方可再用。另外多畜檢查時，需做好登記，附好標簽，以免混亂。3幼蟲分離法。凡是檢查組織器官材料，應盡量撕碎；但檢查糞便時，則將完整糞球放入，不必弄碎，以免渣子落入小試管底部，鏡檢時不易觀察；溫水必須充滿整個小試管和乳膠管，并使其浸泡住被檢材料（使水不致流出為止），中間不得有氣泡或空隙；為了靜態(tài)觀察幼蟲形態(tài)構造，可用酒精燈加熱或滴入少量碘液，將載片上的幼蟲殺死后進行觀察。4寄生蟲學測微法。注

14、意某個顯微鏡測出的目鏡測微尺每格的長度只適用于該顯微鏡一定的目鏡倍數(shù)和一定的物鏡倍數(shù)。更換其中任一因素，其每格的長度必須重新測量換算。此外，如需要用油鏡時，必須在物鏡測微尺上加蓋玻片后再測量，以免損壞格線。五、實驗報告1記錄上述各種糞檢技術結果，并對相關方法做簡要敘述和概括總結。2繪出一個線蟲三期幼蟲形態(tài)圖，并注明其各部構造名稱。附：參考資料 1網(wǎng)尾線蟲、原圓線蟲和后圓線蟲第一期幼蟲的形態(tài)區(qū)別。家畜肺線蟲中網(wǎng)尾線蟲、原圓線蟲和后圓線蟲第一期幼蟲的形態(tài)區(qū)別主要是根據(jù)其大小、頭鈕的有無、及尾部的形態(tài)特點和背刺的有無來進行區(qū)別。(表2-1) (圖2-9)表2-1 家畜肺線蟲第一期幼蟲的鑒別特征（Yang, 2004）項 目網(wǎng)尾線蟲