凝膠成像及Quantity-One中文操作說明

1、第一章簡(jiǎn)介凝膠電泳是每個(gè)做分子生物學(xué)的研究者天天都耍打交道的根本技術(shù)。電泳之后的信息處理與電泳本身同樣重要。目前有大量軟件可以用于分析電泳結(jié)果，要向大家介紹的是 Bio-Rad公司的1D凝膠分析軟件Quantity One ( Bio-Rad還有一個(gè)做2D凝膠分析的軟件PDQuest)。Quantity One軟件是常用1D凝膠分 析軟件中功能最強(qiáng)大，自動(dòng)化程度最高的軟件。這個(gè)軟件的最新版本可以在Bio-Rad的網(wǎng)()免費(fèi)下載，以供試用或用戶升級(jí)之用。Quantity One軟件的主要功能包括定量分析 (Volumes Quick Guide)，電泳條帶分析(Band Analysis) 差顯

2、分析(Differential Display Analysis)，克隆計(jì)數(shù)(Colony Counting Analysis) 等，此外，還可以直接控制Bio-Rad公司的各類圖像儀和 ExQuest自動(dòng)切膠儀，使您的凝膠分析工作變得極為輕松。Quantity One 軟件擁有與windows操作系統(tǒng)下絕大多數(shù)應(yīng)用軟件相同的友好界面。til* &da Jfi« la«4t Liaifudi Vii»» AhAjriM 備騎計(jì)加如血Mtil簞血t fkiie Qai山仏血 tnptjng Qwivk 4uid«fimdk GnitI f

3、it&d. iaedjrin Qiicfc 施J 血 C»l«ny Cwtic ck 缸皿心乳桃致Qoj EID SS?r!匚 Critenor. HE iButeJUdi CMIfMi t*d IultiEtyVvvd Ltnrijrlapjntlic Jrtt仇Mt托H 弟idsTrWSlWfr2 ZixMiB&xDafftrinud Oi fiitdi fm-dlikuiAti tf 4m|t(ilttr89VqimeRed Twt VAmerieelHnj lodVflMncCcntfti T«l 占如t TooT'CjWSfl 1

4、«1網(wǎng)兇1；V -ckk com a mT tan M2 Mb s Me&k插入密碼狗，翻開 Quantity One軟件，可以看到最上緣藍(lán)色橫條幅是標(biāo)題欄，往下依次是菜單欄和 工具欄。File圖像翻開、保存、引入、打印Ma分子量估算、條帶匹配分析等操作tchEdit圖像普通編輯操作Vo定量分析lumnView圖像縮放、三維視圖、看光密An濃度估算、克隆計(jì)數(shù)等分析Imag圖像旋轉(zhuǎn)、翻轉(zhuǎn)、裁切等操作Re分析結(jié)果輸岀portsLane泳道分析Wi窗口分析ndowBand條帶分析He幫助、快捷菜單、軟件注冊(cè)Ip等每個(gè)菜單的主要功能如下：往下一行是工具欄，上面每個(gè)按鈕的功能見下表:翻

5、開立fk圖像顯示控制存條帶分析工具*J保存操作界c顯示條帶！匹配工具a打申圖像、L去除分析標(biāo)記“輪處修改工具,cP看余圖卩圈像工具打印快捷指南J局部放大護(hù)電文字工舟|定量分析快捶指南日拖處am> p定量工具八條帶分析快捶指南門放大并居中HU I1 *灰度分析工斗克隆計(jì)數(shù)快捶指南戶縮小并居中護(hù)rmrnw *泳道分析工具誤Quantity One 軟件Help aQuick Guide快捷指南提示如何實(shí)現(xiàn)一個(gè)功能，如定量分析(Volumes QuickGuide)，電泳條帶分析(Band Analysis)，差顯分析(Differential Display Analysis)，克隆計(jì)數(shù)(C

6、olony Counting Analysis) 等?？旖葜改舷掠?，2，3步驟，根據(jù)提示完成。使用Quantity One軟件進(jìn)行電泳結(jié)果分析，通常包括圖像獲取、圖像預(yù)處理、分析、結(jié)果輸出四部分。圖像獲取就是通過軟件控制掃描儀(GS-800 PharosFX等)或凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc、ChemiDoc. VersaDoc等)，圖像預(yù)處理就是將掃描或拍照獲得的原始圖像進(jìn)行初步處理，以便更好地進(jìn)行后續(xù)分析。接下來是分析過程，根據(jù)分析的方法和目的不同，又可以分為定量分析、條帶分析、克隆計(jì)數(shù)、差異(聚類)分析 等等。不管如何分析，最終我們都必須通過軟件的輸岀功能，得到我們想要的結(jié)果。Quant

7、ity One軟件提供了多種結(jié)果輸岀方式。在接下來的幾章里，我們將按照這個(gè)思路，一步步引導(dǎo)您使用這一軟件Acquire ImejeOpting ;e Umag普Lane and Bard Analysis ;o ume Analysis Colony CotntngRepot ResultsRg. 1-2 Quantity One workflow第二章圖像獲取Quantity One 4.4 4.6版本可以控制 Bio-Rad目前幾乎所有的圖像儀，如GelDoc XR ChemiDocXRS等。這些圖像儀采集到的圖像，可以直接保存成軟件可直接分析的圖像，即擴(kuò)展名1sc的原始圖像文件。下面將具

8、體介紹如何通過 Quantity One 軟件從GelDoc XR獲取圖像。GelDoc XR是Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中最常用，操作最簡(jiǎn)便的儀器，它可以用來拍攝EB SYBFGreen等染料染的核酸電泳凝膠；Sypro Ruby、銀染、考馬斯亮藍(lán)等方法染的蛋白電泳凝膠；以及化學(xué)顯色的印記膜等。使用GelDoc XR之前，先接通電源，翻開位于儀器反面右下角的電源開關(guān)；然后根據(jù)具體的應(yīng)用選 擇適宜的照明和濾光片位置。原那么如下：表格形式模式1.如果樣品是通過EB SYBR Green Sypro Ruby等染料通過紫外激發(fā)來顯色，就先將樣品置于紫外 透射平臺(tái)(UV Transilluminat

9、or)的中間，關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“Trans UV按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“ I 處。模式2.如果樣品是通過金屬銀、考馬斯亮藍(lán)等染料染色，就先將白光轉(zhuǎn)換屏(White Light ConversionScreen)取下，翻開下部的開關(guān)，放在紫外透射平臺(tái)上，樣品置于白光轉(zhuǎn)換屏中間。關(guān)上暗箱門，然后按下 面板上的“ Trans White "按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“I 處。模式3.如果是化學(xué)顯色等非透明可見樣品，那么用模式2中所示方法，將樣品置于白光轉(zhuǎn)換屏中間。關(guān)上暗箱門，然后按下面板上的“ Epi White按鈕，并將濾光片選擇桿置于位置“O處。接下來翻開Qua

10、ntity One 軟件，選擇File?GelDoc XR，按以下順序操作:口抵欝農(nóng)氐1 0*亡 Qomt. it> One ft. 0 (Uiuicll:Lt 411 tiE 址5 Lttv >Uix9 |ktL YgliaM iJlilxiiiLfrd«n Rilpzuaw racusCUV pWhle切母i Aewic6鋼o豁|iBpiv 0mETUi®iw.±1U萌 gm 1 voMwla&0u-=五 o ID qi: (Si bu 1 at i onlQH4HdgK *54ta4Hl PM QfcwOBpiflf 按下Live/Foc

11、us，成像儀進(jìn)入實(shí)時(shí)成像； 選擇照明模式，一般核酸膠用UV,蛋白膠用 White模式； 注意，選擇完成后，要按下成像儀面板上相應(yīng)的光源按鈕 此功能有三個(gè)上下鍵按鈕：IRIS 光圈，ZOOM縮放，F(xiàn)OCUS聚焦，您可在軟件上直接 調(diào)節(jié)或在儀器面板上手工調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)步驟：a調(diào)大IRIS，以看到圖像b點(diǎn)ZOOM備膠適當(dāng)放大c調(diào)節(jié)IRIS至適宜大小一般情況下盡量選擇小光圈，因?yàn)樾」馊吧畲螅瑘D像更清晰d調(diào)節(jié)FOCUS至圖像最清晰按 按“ Auto Expose ；如是，單擊 Auto Expose,系統(tǒng)將自動(dòng)選擇曝光時(shí)間成像，如不滿意，單擊ManualExpose，并輸入曝光時(shí)間秒，圖像滿意后保存，在自動(dòng)

12、曝光期間，圖象會(huì)持續(xù)的輸入到CCD中，直到達(dá)到一定比例的飽和象素值，此比例在Options dialog box 中設(shè)定默認(rèn)值=0.15 %。AlxcClick on Autobutton aopers depessrc：Sxi III A.xpi« Inmj*rffcivartdEnriiue Tini h »1Car see 于pou ne _ime iiTLomaticaily changingO Frsuef kpMlf# 1 FT* (SM)SfeOl I AtUUntsI laJtfJ_±C ick cc Freeze to stop te eitpo

13、sLire processFig. &*6. Freezing trie exposure.一旦圖象質(zhì)量到達(dá)要求，點(diǎn)擊Freeze button 來終止曝光。 如是蛋白凝膠，接第 6步直接將清晰的圖像保存即可 按下“ Analyze ；這將會(huì)翻開一個(gè)新的窗口來顯示捕獲的圖象，該圖象具有默認(rèn)名稱，具有日 期、時(shí)間及用戶名如果的話等信息。按下“ Save鍵，保存圖像。第三章圖像分析Quantity One的圖像分析功能相當(dāng)強(qiáng)大，根據(jù)不同的需要，可以分為定量分析、條帶分析、相似性 分析以及克隆計(jì)數(shù)用于藍(lán)白斑篩選等等，而且每種分析法都有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)和輸岀方式。本章重點(diǎn)介紹常 用的定量分析和條帶分

14、析方法，其余更細(xì)更深的功能請(qǐng)參考軟件自帶的用戶手冊(cè)。一.定量分析 Volumn Analysis 定量分析是計(jì)算選定區(qū)域內(nèi)信號(hào)強(qiáng)度的總和，是Quantity One最方便的定量工具。這種分析方式考慮選定區(qū)域的真實(shí)形狀，可用于電泳條帶、斑點(diǎn)、大型芯片等圖像的定量。這種定量的方法可以扣除背景， 可以按照用戶的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算岀條帶或斑點(diǎn)的濃度，但它不能計(jì)算分子量，也不能進(jìn)行條帶匹配和相似性 分析。Quantity One軟件稱這類定量的結(jié)果為 Volume。Volume =選定區(qū)域內(nèi)所有像素信號(hào)強(qiáng)度的總和x像素面積Volume 的單位：int x mrh快捷指南Volumes Quick Guide，

15、能夠指導(dǎo)您對(duì)任意所選區(qū)域進(jìn)行定量分析，此分析可以報(bào)告多種結(jié)果，常用的結(jié)果是相對(duì)濃度和絕對(duì)濃度須提供標(biāo)準(zhǔn)品。具體的操作方法如下："：J 3 T rnskicnL''5 Vofc/neFiee htfwi Tool& VofejieCortour Ido)? Ssfect fooJ;'S PrW .''§RewxtCwcfck awwiru IxwShJlsMi nlihfr 4 raluna hat1選擇成像系統(tǒng)或翻開已保存的文件軟件可以控制Bio-Rad所有的成像系統(tǒng)如GelDoc,ChemiDoc,VersaDoc,GS-8

16、00,FX,如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 1文件格式，軟件也可進(jìn)行分析處理2. Zoom Box，縮放，對(duì)圖象進(jìn)行放大觀察3. Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的比照度黑白4. 選擇待分析區(qū)域：Volumn Contour Tool等高線勾勒區(qū)域，自動(dòng)連接濃度相同的點(diǎn)，如U1Volume Free hand Tool自由畫筆選擇區(qū)域，可以勾勒出無規(guī)那么形狀，如U2Volume Rect Tool矩形區(qū)域選擇，如 U3Volumn Circle Tool圓形選擇區(qū)域，如 U4按上面4種方法選擇需要定量的區(qū)域。5. 雙擊所選區(qū)域，岀現(xiàn)如下窗口，定義樣品類型，如未知

17、樣品景BackgroundB1,B2，軟件在算濃度時(shí)會(huì)將此區(qū)域的濃度自動(dòng)扣除 如果該樣品是濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品，即定量標(biāo)準(zhǔn)，需在濃度concentrationUnkonwnU1,U2即待計(jì)算樣品，背或標(biāo)準(zhǔn)樣品 Standard Std1,Std2,一欄輸入該樣品的濃度。6. Select Tool 選擇不同區(qū)域7. Print Image 打印圖像8. Volume Analysis Report定量報(bào)告結(jié)果，翻開出現(xiàn)如下窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，主要有2個(gè)參數(shù) Volume、adj. Vol.( 即 adjusted volume) 和 Concentration 。Volume 為定量值，adj.

18、Vol. 為扣除 背景后的定量值，如有濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品( Std)，軟件可報(bào)告Concentration 絕對(duì)濃度。參數(shù)選好后，按下按 鈕“ done。txt文件，按左側(cè)打印按鈕，可將報(bào)告9. 軟件報(bào)告如下列圖所示：按右側(cè)輸岀按鈕，可將表格保存成打印岀來二.條帶分析(Band Analysis )條帶分析是Quantity One最根本的分析工具，它可以自動(dòng)識(shí)別電泳泳道和識(shí)別條帶，依據(jù)泳道的平 均光密度和條帶寬度對(duì)每個(gè)條帶進(jìn)行模式化定量。這種分析方式雖然不如定量分析來得方便，但這樣可以 實(shí)現(xiàn)非常復(fù)雜的電泳分析，滿足各種不同的結(jié)果需要。這種方式的最大優(yōu)點(diǎn)在于它可以完全拋棄人為主觀 因素而進(jìn)行全自動(dòng)定

19、量。用條帶分析的方法進(jìn)行定量的結(jié)果叫Trace Quantity ( Trace Qty )，計(jì)算方法是：首先軟件自動(dòng)計(jì)算條帶上每一橫排像素的平均光密度和平均光密度分布曲線，然后每個(gè)具體條帶的定量值是平均光密度曲線的 線下面積的積分，即：Trace Quantity =平均光密度x條帶上下邊界的距離Trace Quantity的單位：OD*mmruxrLrLTLnruxrLrLTLnLane Sampling AictnSanaHehtLane Sampling AictnLane TraceLane TraceAverage interisityP«akBand Prolile&#

20、169;劉購e pH>el i“t的 $itycro$5 $snpfe width -integrate under curve (o selin« for bard quantitatm (和即對(duì) x mm J.條帶分析中的條帶定星鯉下面介紹用此功能對(duì)泳道內(nèi)的所有條帶進(jìn)行分子量確定，相對(duì)濃度分析述 IldnsfCKITL. Frerns Lanaa.5l Strdch Frame6 Add/diurt Anehcti ? Lin# Bdckotound 0- Detect Band.9lIQ R陰加比*一11 Match12 Pkinl Image.* 勻 Al LantJ

21、Retwl.1翻開已保存的文件(如不是Bio-Rad成像系統(tǒng)所攝取的圖象，將圖象保存為Tiff 1文件格式,軟件也可進(jìn)行分析處理)2. Zoom Box，縮放，對(duì)圖象進(jìn)行放大觀察3. Transform轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)圖象的比照度黑白4. 確定泳道(lane),并對(duì)泳道進(jìn)行各種調(diào)整(實(shí)際實(shí)驗(yàn)中泳道往往不是垂直的而出現(xiàn)各種變形)按下列圖所示在軟件的工具欄中有一Lane Tool圖標(biāo)，包含有更多泳道編輯工具。Lane T00I+1汙道編輯工具包RsN T«wl %Lu# 1*41 «組匸一二土總匕二上.上±3:&-FFMWLWWt .SiretchFiarieAdW

22、Adfu 科 Aik bn &Re«W4-AnclMartCr«*e LwAdfjti LaceU 論*it LdWRftmfivt LamLane-V/idth .Ln & 4dwvwdPfalLare匚Lihti .- -? M 孑 一 -* 一 ?" « -7 7 - 一 « 7 一 ? « _? - - 丁. - a1!-翕一Fantwe EjndPh* BandV' Vii1. - nljrwLendAlritM?：Afkrf EjndBand TooIp條帶編輯工具邑心5. 選擇Frame Lane

23、s，輸入圖像頭際泳道(lane)數(shù)并確認(rèn)。此時(shí)圖像上泳道的位置上會(huì)出現(xiàn)一條條 紅線，每條紅線就代表一根泳道。6. 選擇Add/Adjust Anchors，此時(shí)泳道紅線上會(huì)出現(xiàn)一些小圓圈。這些小圓圈稱為錨定點(diǎn)(anchor)， 錨定點(diǎn)規(guī)定了泳道走向。當(dāng)泳道不直時(shí)，點(diǎn)擊岀現(xiàn)彎曲的泳道部位，就可以增加錨定點(diǎn)。鼠標(biāo)按住錨定點(diǎn)， 可以拖動(dòng)錨定點(diǎn)，讓每根紅線始終位于泳道的中間線上。7. Lane Background去除泳道背景。點(diǎn)擊該按鈕，選擇一條適當(dāng)?shù)挠镜傈c(diǎn)擊之，然后在彈岀的對(duì)話框中選“ All Lane On "，在“ Rolling Disk Size 中填入適當(dāng)?shù)臄?shù)值18. Dete

24、ct Band，檢測(cè)泳道內(nèi)的條帶，翻開出現(xiàn)如下窗口。通過調(diào)節(jié)sensitivity 靈敏度可調(diào)節(jié)檢測(cè)岀的條帶數(shù)，調(diào)節(jié)Lane Width使代表表帶的紅色橫線與條帶寬度差不多寬。中間一行人工編輯按鈕可以 用來增加/減少條帶、調(diào)節(jié)條帶的上、下邊界等。翻開工具欄中Band Tool條帶編輯工具包可看到更多編輯工具如上圖匚 U tlErt Vu-fxi - Pr4ii=«ibv!* .Ri-attawGAiPOneOfW忖曲朗rWarvitg層trffYrirniShodv*:(S'Aw cut廣合 circJEm窯airiii*人工編輯按鈕 割圜到SemiMly 10.000s r

25、*314 >1 Dm 即 I t.iXiHauFior 4 CM$JfiAHScrv | 1 .OQ創(chuàng)*1±I*J*1+J 創(chuàng)±Jd±創(chuàng)*|Meet?i»Swie s-9. Standard輸入分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件自帶有許多Bio-Rad的分子量標(biāo)準(zhǔn)，如你用的是自己的標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)入New Standard建立新的分子量標(biāo)準(zhǔn)，軟件可以選擇標(biāo)準(zhǔn)單位是MW蛋白質(zhì)還是 BP 核酸等左下列圖。在Protein-Standard對(duì)話框中輸入分子量數(shù)值，完成后單擊賦值圖標(biāo)右下列圖，回到圖象文件上單擊標(biāo)準(zhǔn)樣品的泳道，軟件自動(dòng)將所輸?shù)姆肿恿繑?shù)值和泳道內(nèi)的條帶一一對(duì)應(yīng)。匚 Q

26、ikAti *蕈UtSefeeiUiMsBase Furs- AsceadlngIQCleqtiq Point-AscendingIso«leccEic Folh-t-D電日匚電ndxntjUTaleculaE ITeighc.- AscendingMaraLaliEfd Rt-DtaccndinEdt I HewCarKd|賦值酢： 告訴時(shí)盹彩SMviifd ?ba4 珂 I£<wwr/gg r1IWt血血型墨I(xiàn) id找1010. Band Attribute條帶屬性，在完成第9步以后，軟件已自動(dòng)計(jì)算出了其他未知條帶的分子量扌丁開band attribute選擇要報(bào)

27、告的參數(shù)，這里我們選擇 Molecular Weight分子量紅顏色標(biāo)記，標(biāo)準(zhǔn)分子量為藍(lán)色標(biāo)記。圖象上可以看到所有條帶的a ¥ 占 口 r % 4 3" -霑盂 7二？1 _ 忙 r a kD戶 41m廣1 nd; IhJrtbii廠IINWIe爐35廣J &«W廣Ji 理嚴(yán) TfdvO.L*廣 0«#1< fw*. 5". f* t4M T *P 舛 r w*hp務(wù) 廠fww 廣 Dvil jpi r 士rtThpCgrtwJRRp ritaMdMVr r EmtHsM L211. Print Image 打印圖象DbWIhMhftl LdIHMI Hmm?1Z1L va 尸mlAM荷12. All Lane Report所有泳道條帶結(jié)果報(bào)告。翻開窗口，選擇要報(bào)告的參數(shù)，如.分子量，如左下列圖，軟件將報(bào)告結(jié)果右下列圖，在報(bào)告的右下腳有一報(bào)告輸出工具，點(diǎn)擊可將報(bào)告結(jié)果輸出成.txt文本格式或輸出至剪貼板，可粘貼到 EXCEL WOR等文件下。LtaM 1OaM*1。躺敬1匸帰3聲啊口常10.PPrioriWHI WTfJ* Li忖FCwnv-"