紫蘇葉提取物抗家兔動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究

1、紫蘇葉提取物抗家兔動(dòng)脈粥樣硬化的實(shí)驗(yàn)研究 09-09-03 14:47:00 編輯：studa20 作者：陳眷華 譚健民 徐在品 陳超 霍欣 鄧小燕 張迪 簡(jiǎn)秀華【摘要】 目的探討紫蘇葉提取物(FPE)對(duì)由高脂高膽固醇引起家兔動(dòng)脈粥樣化的影響。方法采用高脂高膽固醇飼喂法建立家兔動(dòng)脈粥樣硬化模型，分別測(cè)定正常對(duì)照組、高脂模型組、紫蘇葉提取物低劑量組（0.17 gkg-1）、中劑量組（0.5 gkg-1）、高劑量組（1.5 gkg-1）血清中TC，TG，LDL-C，HDL-C，MDA含量及SOD的活性，大體染色計(jì)算脂肪斑塊面積比（PA），組織切片觀察主動(dòng)脈內(nèi)膜增生(IH)。結(jié)果FPE組均能明顯降低

2、血清中TC，TG，LDL-C，MDA的含量（P0.01），并能升高血清中HDL-C的含量（P0.01）和SOD的活性（P0.05），F(xiàn)PE干預(yù)組PA值下降明顯，F(xiàn)PE中劑量組、高劑量組與高脂模型組比較具有統(tǒng)計(jì)意義 分別為（21.527.58）%，P0.05；（15.823.64）%，P0.01；（53.5929.31）%。病理切片顯示，各用藥組主動(dòng)脈IH程度均小于高脂模型組，其中高劑量用藥組AS程度最小。結(jié)論 紫蘇葉提取物具有抗高脂飲食誘導(dǎo)家兔動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其作用機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)血脂與抗脂質(zhì)過氧化有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 動(dòng)脈粥樣硬化 紫蘇葉提取物 血脂 脂質(zhì)過氧化 家兔動(dòng)脈粥樣硬化(Athe

3、rosclerosis, AS)是以動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、脂質(zhì)沉積、炎癥反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞遷移與增殖為主的病理改變，是導(dǎo)致心腦血管疾病的直接原因1?，F(xiàn)代藥理研究表明，紫蘇葉的主要成分迷迭香酸及黃酮類化合物具有抗氧化、清除自由基及改善血液流變學(xué)等作用2,3。已有的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明紫蘇葉具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理基礎(chǔ)，但目前有關(guān)其抗AS的實(shí)驗(yàn)研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從紫蘇藥理理論出發(fā)，研究紫蘇葉提取物抗家兔動(dòng)脈粥樣硬化作用，為拓展紫蘇的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。 1 材料與儀器 1.1 藥物紫蘇葉提取物(FPE)：紫蘇葉購(gòu)于貴陽(yáng)市中藥公司，由貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備，藥物濃度為每毫升含原生藥

4、1 g。 1.2 動(dòng)物體重1.82.0 kg新西蘭大白兔30只，雄性，由貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。 1.3 飼料為機(jī)制顆粒飼料?；A(chǔ)飼料配方：玉米35，小麥25，麥麩35，魚粉2，骨粉2，鹽1；高脂飼料配方1.5 %膽固醇+ 10 %煉制豬油+ 88.5%基礎(chǔ)飼料。 1.4 儀器與試劑旋片式真空泵（浙江黃巖求精真空泵廠）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TDl-5A離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)，LEICA Rm2125）；光學(xué)顯微鏡（日本，OLYMPUS CX31）；722光柵分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；膽固醇（上海山浦化工有限公司，化學(xué)純

5、）；甘油三酯測(cè)定試劑盒、總膽固醇測(cè)定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物制品研究所。 2 方法 2.1 紫蘇葉提取物的制備取干紫蘇葉，適度粉碎后過20目篩備用，稱取樣品100 g，按固液比為115加入新鮮蒸餾水，煎煮至沸騰后，再繼續(xù)煎煮15 min，趁熱4層紗布過濾，濾渣按固液比為112加入新鮮蒸餾水重提1次，過濾，合并兩次濾液，用文火將濾液濃縮至300 ml，待濃縮液冷卻后，加入3倍量95%乙醇于4下放置12 h，沉淀后以3 000 rmin-1離心3 min，取上清液進(jìn)行抽濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無乙醇味為止，最后定容至100 ml，即每毫升提

6、取液含原生藥1 g。 2.2 動(dòng)物分組與給藥實(shí)驗(yàn)分別設(shè)正常對(duì)照組、高脂模型組、FPE低劑組（紫蘇組）、FPE中劑量組（紫蘇組）、FPE高劑量組（紫蘇組）（藥物劑量分別為0.17，0.5，1.5 gkg-1）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用基礎(chǔ)飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，然后隨機(jī)分為5組，每組6只。正常對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，高脂模型組飼喂高脂飼料，用藥組飼喂高脂飼料并灌胃 FPE相應(yīng)劑量的藥物，同時(shí)模型組與正常對(duì)照組均灌胃等量蒸餾水。灌胃量為每只兔子3 mld-1，共8周。 2.3 觀察指標(biāo) 分別于實(shí)驗(yàn)前1天、第4周末和第8周末，清晨空腹行耳中動(dòng)脈采血3.54.0 ml，分離血清，按各檢測(cè)試劑盒的操作方法，測(cè)定總膽固醇 (

7、TC)、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C)、丙二醛（MDA）的濃度及超氧化物歧化酶（SOD）的活性。 2.4 主動(dòng)脈組織學(xué)觀察動(dòng)物于第8周末頸動(dòng)脈放血處死，完整取出胸主動(dòng)脈于10%福爾馬林中固定12 h。按劉氏等方法4計(jì)算脂質(zhì)斑塊面積百分比（percentage of plaques covering aortic intima, PA）：PA=脂質(zhì)斑塊面積/胸主動(dòng)脈總面積100%，比較各組PA的差異。同時(shí)取近心端5 mm處主動(dòng)脈，常規(guī)制作石蠟切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色，比較光鏡下血管內(nèi)膜增生程度。 2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用s表示，

8、SPSS10.0 (ONE-WAYANOVA)進(jìn)行方差分析。 3 結(jié)果 3.1 FPE對(duì)血清中血脂水平的影響經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，模型組在實(shí)驗(yàn)中期（第4周末）與實(shí)驗(yàn)?zāi)┢冢ǖ?周末）TC，TG的濃度明顯高于同期正常對(duì)照組（P0.01）；FPE 3個(gè)劑量組：TC，TG的濃度明顯低于同期高脂模型組，除FPE組TC第4周末無統(tǒng)計(jì)意義外，其余各組表現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01或P0.05）；LDL-C實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诿黠@低于高脂模型組并差異極顯著（P0.01）；HDL-C的濃度實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诿黠@高于高脂模型組（P0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FPE具有一定調(diào)節(jié)血脂的作用。見表14。表1 FPE對(duì)血清中總膽固醇（TC）含量的影響 表2

9、 FPE對(duì)血清中甘油三酯（TG）含量的影響表3 FPE對(duì)血清中低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量的影響表4 FPE對(duì)血清中高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）含量的影響與正常照組比較，P0.05，P0.01；與高脂模型組比較，#P0.05，#P0.01；紫蘇組間的比較，AP0.05，BP0.01；n=6 3.2 FPE對(duì)血清中脂質(zhì)過氧化的影響經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)第4周末，F(xiàn)PE 3個(gè)劑量組MDA的含量均低于高脂模型組，但無顯著性差異，第8周末中劑量組與高劑量組明顯低于高脂模型組，并且表現(xiàn)出差異極顯著（P0.01）；用藥組在實(shí)驗(yàn)第4周末，其中高劑量組血清中SOD的活性明顯高于模型組（P0.01），第

10、8周末，中劑量組與高劑量組與高脂模型組比較有顯著性差異（P0.05）。結(jié)果見表56。表5 FPE對(duì)血清中丙二醛（MDA）含量的影響表6 FPE對(duì)血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響與正常對(duì)照組比較，P0.05，P0.01；與高脂模型組比較，# P0.05，#P0.01；n=6 3.3 胸主動(dòng)脈AS病理觀察結(jié)果胸主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊經(jīng)蘇丹染色顯示，空白對(duì)照組家兔胸主動(dòng)脈內(nèi)表面光滑，未見脂質(zhì)斑塊。高脂模型組、FPE 3個(gè)劑量組胸主動(dòng)脈內(nèi)膜均見不同程度的紅色斑塊，呈點(diǎn)、斑、條狀，有些融合成片, 表面粗糙不平，突出于內(nèi)膜表面，病變以主動(dòng)脈弓處最為嚴(yán)重。其中高脂模型組病變最為嚴(yán)重，胸主動(dòng)脈內(nèi)膜面幾乎全為融

11、合的脂質(zhì)斑塊所覆蓋。FPE組病變程度與高脂模型組相仿，F(xiàn)PE組病變最輕僅在主動(dòng)脈根部有散在的點(diǎn)狀病灶及融合為一小面積斑塊，F(xiàn)PE組病變程度介于FPE 和FPE組之間，見圖1。PA經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析顯示，F(xiàn)PE 組PA值（15.823.64）%，F(xiàn)PE PA（21.527.58）%，F(xiàn)PE組PA（39.5713.06）%，高脂模型組PA（53.5929.31）%，用藥組PA明顯低于模型組，并且FPE 組和FPE 具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05或P0.01）。見表7。 09-09-03 14:47:00 編輯：studa20 PA=脂質(zhì)斑塊面積/主動(dòng)脈面積100% HE染色顯示，空白對(duì)照組血管內(nèi)膜光滑，無粥樣

12、硬化斑塊突出，內(nèi)膜、中膜、外膜三層結(jié)構(gòu)清楚。高脂模型組血管可見明顯粥樣硬化斑塊突出于整個(gè)內(nèi)膜，纖維帽下可見大量的泡沫細(xì)胞，斑塊根部可見細(xì)胞碎片，大量的巨噬細(xì)胞和梭形細(xì)胞穿插其間，中膜平滑肌受壓萎縮，并可見平滑肌增生向內(nèi)膜層移行。FPE組病變與高脂模型組相仿，脂質(zhì)斑塊占管腔的面積較模型組低。FPE組病變最輕，血管內(nèi)膜增生不明顯，僅在局部有輕微的脂質(zhì)斑塊增生，F(xiàn)PE的病變程度介于高劑量和低劑量之間。見圖2。 a空白對(duì)照組 b高脂模型組 cFPE低劑量組 dFPE高劑量組 eFPE中劑量組 圖1 各組家兔胸主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊病理變化（蘇丹染色） a空白對(duì)照組（100） b高脂模型組（100） cFPE低

13、劑量組 （100） dFPE高劑量組（100） eFPE中劑量組（100） 圖2 各組家兔主動(dòng)脈內(nèi)膜增生病理變化（HE染色） 表7 胸主動(dòng)脈前段脂質(zhì)面積百分比PA值比較(s) 組別PA值正常對(duì)照0高脂模型53.5929.31蘇葉39.5713.06蘇葉21.527.58*蘇葉15.823.64* 與高脂模型組比較，*P0.05，*P0.01；n=6 4 討論 本實(shí)驗(yàn)用高脂高膽固醇飲食建立家兔AS 動(dòng)物模型，胸主動(dòng)脈大體觀察見明顯粥樣斑塊，病理切片見血管內(nèi)皮下由泡沫細(xì)胞組成的脂質(zhì)斑塊，證明成功建立AS模型。 目前有關(guān)AS 形成的學(xué)說眾多，主要有內(nèi)皮細(xì)胞損傷學(xué)說、脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說及微血栓形成學(xué)說，而內(nèi)

14、皮細(xì)胞損傷學(xué)說最受人們所重視。各種原因造成的動(dòng)脈內(nèi)膜損傷是動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)生的關(guān)鍵因素，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可以引發(fā)一系列變化，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。如氧化型低密度脂蛋白(OXLDL) 及氧化自由基損傷血管壁，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損后壞死、脫落，局部膠原纖維暴露、血小板粘附、聚集，釋放各種趨化因子及生長(zhǎng)因子，使局部膠原纖維合成增加、單核細(xì)胞附壁浸潤(rùn)，中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移、增殖，這些細(xì)胞發(fā)生表型的改變，吞噬大量脂質(zhì)、形成泡沫細(xì)胞最終導(dǎo)致AS5。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)PE能夠提高家兔SOD的活性并降低MDA的含量。病理切片顯示，動(dòng)脈粥樣硬化程度與藥物劑量相關(guān)，藥物劑量越大，病變程度越小，因此認(rèn)為

15、FPE抗AS作用可能與清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化損傷的藥理作用有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)研究表明，紫蘇葉提取物用藥組（0.17，0.5，1.5 gkg-1）均能明顯降低血清中TC，TG，LDL-C的含量（P0.01），并能升高血清中HDL-C的水平，表現(xiàn)出良好的調(diào)節(jié)血脂的作用?，F(xiàn)已公認(rèn)高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化病變的最主要原因，內(nèi)膜中脂質(zhì)沉積被認(rèn)為是AS病變的早期表現(xiàn)。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，中藥可通過調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂來抑制AS 的形成69。因此筆者認(rèn)為，F(xiàn)PE調(diào)整血脂代謝可能是其抗AS的其中一個(gè)藥理基礎(chǔ)。 綜上所述，紫蘇葉提取物具有抗AS的作用，可能與其抗脂質(zhì)過氧化及調(diào)節(jié)血脂作用有關(guān)，對(duì)于其具體作用機(jī)制還有待作進(jìn)一

16、步的研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 許文亮,郭新貴,徐延路,等. 冠心病患者血漿膽固醇與內(nèi)皮素-1、C-反應(yīng)蛋白及血小板可溶性P選擇素相關(guān)性研究J.新醫(yī)學(xué), 2004, 35 (6)：330.2 呂曉玲,朱惠麗,姜平平,等.紫蘇提取物抗氧化活性體外實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)食品添加劑,2003,5：22.3 徐在品,鄧小燕,門吉英,等.紫蘇不同部位提取物對(duì)大鼠血液流變性的影響J.生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志, 2006,23 (4)：762.4 劉發(fā)益,文志斌,尚改萍，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯抗家兔動(dòng)脈粥樣硬化形成的實(shí)驗(yàn)研究J.湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,25 (1)：33.5 薛文雋, 吳國(guó)忠.中藥抗動(dòng)脈粥樣硬化的藥理學(xué)研究進(jìn)展

17、J.上海中醫(yī)藥雜志,2003,37(6)：58.6 戴 敏, 訾曉梅, 彭代銀, 等.丹皮酚抗鵪鶉實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化作用J.中國(guó)中藥雜志,1999, 24(8)：488.7 賀圣文, 趙仁宏, 陳景武, 等.馬齒莧對(duì)家兔實(shí)驗(yàn)性動(dòng)脈粥樣硬化形成的作用J.濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003, 25( 3)：161.8 丁志山, 沃興德.姜黃降血脂抗動(dòng)脈粥樣硬化研究概況J.浙江中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1998, 22(6)：8.9 汪德清, 丁保國(guó), Tomas G Neil, 等.黃芪總黃酮對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化早期形成的影響J.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2003, 19(6)：637. 09-09-03 14:47:00 編輯：st

18、uda20 PA=脂質(zhì)斑塊面積/主動(dòng)脈面積100% HE染色顯示，空白對(duì)照組血管內(nèi)膜光滑，無粥樣硬化斑塊突出，內(nèi)膜、中膜、外膜三層結(jié)構(gòu)清楚。高脂模型組血管可見明顯粥樣硬化斑塊突出于整個(gè)內(nèi)膜，纖維帽下可見大量的泡沫細(xì)胞，斑塊根部可見細(xì)胞碎片，大量的巨噬細(xì)胞和梭形細(xì)胞穿插其間，中膜平滑肌受壓萎縮，并可見平滑肌增生向內(nèi)膜層移行。FPE組病變與高脂模型組相仿，脂質(zhì)斑塊占管腔的面積較模型組低。FPE組病變最輕，血管內(nèi)膜增生不明顯，僅在局部有輕微的脂質(zhì)斑塊增生，F(xiàn)PE的病變程度介于高劑量和低劑量之間。見圖2。 a空白對(duì)照組 b高脂模型組 cFPE低劑量組 dFPE高劑量組 eFPE中劑量組 圖1 各組家兔

19、胸主動(dòng)脈脂質(zhì)斑塊病理變化（蘇丹染色） a空白對(duì)照組（100） b高脂模型組（100） cFPE低劑量組 （100） dFPE高劑量組（100） eFPE中劑量組（100） 圖2 各組家兔主動(dòng)脈內(nèi)膜增生病理變化（HE染色） 表7 胸主動(dòng)脈前段脂質(zhì)面積百分比PA值比較(s) 組別PA值正常對(duì)照0高脂模型53.5929.31蘇葉39.5713.06蘇葉21.527.58*蘇葉15.823.64* 與高脂模型組比較，*P0.05，*P0.01；n=6 4 討論 本實(shí)驗(yàn)用高脂高膽固醇飲食建立家兔AS 動(dòng)物模型，胸主動(dòng)脈大體觀察見明顯粥樣斑塊，病理切片見血管內(nèi)皮下由泡沫細(xì)胞組成的脂質(zhì)斑塊，證明成功建立AS

20、模型。 目前有關(guān)AS 形成的學(xué)說眾多，主要有內(nèi)皮細(xì)胞損傷學(xué)說、脂質(zhì)浸潤(rùn)學(xué)說及微血栓形成學(xué)說，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷學(xué)說最受人們所重視。各種原因造成的動(dòng)脈內(nèi)膜損傷是動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)生的關(guān)鍵因素，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可以引發(fā)一系列變化，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。如氧化型低密度脂蛋白(OXLDL) 及氧化自由基損傷血管壁，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞受損后壞死、脫落，局部膠原纖維暴露、血小板粘附、聚集，釋放各種趨化因子及生長(zhǎng)因子，使局部膠原纖維合成增加、單核細(xì)胞附壁浸潤(rùn)，中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷移、增殖，這些細(xì)胞發(fā)生表型的改變，吞噬大量脂質(zhì)、形成泡沫細(xì)胞最終導(dǎo)致AS5。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)PE能夠提高家兔SOD的活性并降低MDA的含量。病理切片顯示，動(dòng)脈粥樣硬化程度與藥物劑量相關(guān)，藥物劑量越大，病變程度越小，因此認(rèn)為FPE抗AS作用可能與清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化損傷的藥理作用有關(guān)。 本實(shí)驗(yàn)研究表明，紫蘇葉提取物用藥組（0.17，0.5，1.5 gkg-1）均能明顯降低血清中TC，TG，LDL-C的含量（P0.01），并能升高血清中HDL-C的水平，表現(xiàn)出良好的調(diào)節(jié)血脂的作用?，F(xiàn)已公認(rèn)高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化病變的最主要原因，內(nèi)膜中脂質(zhì)沉積被認(rèn)為是AS病變的早期表現(xiàn)。大量實(shí)驗(yàn)研究表