基因表達調(diào)控及重組DNA技術(shù)

1、1 基因表達調(diào)控及重組基因表達調(diào)控及重組DNADNA技術(shù)技術(shù)2主要內(nèi)容主要內(nèi)容 基因及基因表達調(diào)控相關(guān)概念基因及基因表達調(diào)控相關(guān)概念 原核基因表達調(diào)控基本原理原核基因表達調(diào)控基本原理 真核基因表達調(diào)控基本原理真核基因表達調(diào)控基本原理 重組重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念 重組重組DNADNA技術(shù)技術(shù)基本原理基本原理3 負載特定遺傳信息的負載特定遺傳信息的DNA片段，包括：片段，包括：DNA編碼序列、非編碼調(diào)節(jié)序列和內(nèi)含子序列。編碼序列、非編碼調(diào)節(jié)序列和內(nèi)含子序列。 基因基因 （Gene）4基因組基因組（Genome） 來自一個遺傳體系的一整套遺傳信息來自一個遺傳體系的一整套遺傳信息原核：單個

2、環(huán)狀染色體所含的全部基因原核：單個環(huán)狀染色體所含的全部基因真核：一個生物體的染色體所包含的全部真核：一個生物體的染色體所包含的全部 DNA，又稱染色體基因組，又稱染色體基因組線粒體基因組線粒體基因組葉綠體基因組葉綠體基因組5Human Genome6人類基因組計劃人類基因組計劃（Human Genome Project, HGP） 1985年美國提出年美國提出 計劃投入計劃投入30億美元，億美元，15年完成年完成 1990年正式啟動年正式啟動 英、法、德、日、中國等先后加入英、法、德、日、中國等先后加入中國的任務(wù)：中國的任務(wù)： 人類人類3號染色體短臂上一個約號染色體短臂上一個約30Mb區(qū)域的測

3、序，區(qū)域的測序， 該區(qū)域約占人類整個基因組的該區(qū)域約占人類整個基因組的1。7年年10月月 啟動啟動2000年年 6月月 完成草圖完成草圖2001年年 2月月 nature公布草圖公布草圖 2004年年 10月月 nature公布精度公布精度 99%的測序圖的測序圖 人類基因數(shù)：人類基因數(shù)：2 - 2.5萬萬HGP的進展的進展The post-genome era is coming8譜主為生物學大師譜主為生物學大師耗資耗資200萬完成萬完成 盼未來降價普及盼未來降價普及 助提早預防疾病助提早預防疾病“ 生命天書生命天書” 首份個人基因圖公布首份個人基因圖公布 (2007.5.30) James

4、 Waston9 基因表達調(diào)控基因表達調(diào)控是指細胞生物接受環(huán)境信號刺激或適應環(huán)境營養(yǎng)供給是指細胞生物接受環(huán)境信號刺激或適應環(huán)境營養(yǎng)供給狀況的變化，在基因表達水平上作出應答反應的分子狀況的變化，在基因表達水平上作出應答反應的分子機制。機制。重組重組DNA技術(shù)技術(shù)本質(zhì)上是一項生物技術(shù)，目的在于通過人工重組本質(zhì)上是一項生物技術(shù)，目的在于通過人工重組DNA的的方法，獲得某一目的基因的無性繁殖系方法，獲得某一目的基因的無性繁殖系DNA克隆，或克隆，或使目的基因在一定的表達體系表達有特殊意義的蛋白質(zhì)。使目的基因在一定的表達體系表達有特殊意義的蛋白質(zhì)。主要研究內(nèi)容：基因表達方式、規(guī)律、調(diào)節(jié)機理主要研究內(nèi)容：

5、基因表達方式、規(guī)律、調(diào)節(jié)機理10第一節(jié)第一節(jié) 基因表達調(diào)控基因表達調(diào)控11一、基因表達的概念一、基因表達的概念* 在各種調(diào)節(jié)機制控制下，從基因激活開始，在各種調(diào)節(jié)機制控制下，從基因激活開始，經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程產(chǎn)生具有生物學功能的經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程產(chǎn)生具有生物學功能的蛋白質(zhì)分子，從而賦予細胞一定的功能或表型，蛋白質(zhì)分子，從而賦予細胞一定的功能或表型，或使生物體獲得一定的遺傳性狀?；蚴股矬w獲得一定的遺傳性狀。12 DNA RNA蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄翻譯翻譯逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄簡單定義：轉(zhuǎn)錄簡單定義：轉(zhuǎn)錄 翻譯翻譯廣義：包括廣義：包括 rRNA、tRNA的表達的表達13二、基因表達調(diào)控的意義二、基因表

6、達調(diào)控的意義 生物體基因數(shù)量很多，但在某一特定時期只有一小部分生物體基因數(shù)量很多，但在某一特定時期只有一小部分基因處于活化狀態(tài)，能進行轉(zhuǎn)錄（例如，真核細胞約基因處于活化狀態(tài)，能進行轉(zhuǎn)錄（例如，真核細胞約2 25 5基因具轉(zhuǎn)錄活性）。因此，機體內(nèi)存在著復雜的調(diào)節(jié)機基因具轉(zhuǎn)錄活性）。因此，機體內(nèi)存在著復雜的調(diào)節(jié)機制，調(diào)節(jié)基因的表達。制，調(diào)節(jié)基因的表達。通過調(diào)控基因的表達，使生物體適應環(huán)境、通過調(diào)控基因的表達，使生物體適應環(huán)境、調(diào)節(jié)代謝、維持其生長與繁殖。調(diào)節(jié)代謝、維持其生長與繁殖。基因表達調(diào)控的意義：基因表達調(diào)控的意義：14三、基因表達的規(guī)律三、基因表達的規(guī)律* 階段特異性階段特異性 （時間特異性

7、）（時間特異性） 組織特異性組織特異性 （空間特異性）（空間特異性）15 階段特異性階段特異性 （時間特異性）（時間特異性）甲胎蛋白甲胎蛋白 某一特定基因的表達嚴格按一定的時間順序發(fā)某一特定基因的表達嚴格按一定的時間順序發(fā) 生，稱生，稱時間特異性時間特異性* 多細胞生物的不同基因在不同發(fā)育階段按特定多細胞生物的不同基因在不同發(fā)育階段按特定 時間順序開啟和關(guān)閉，稱時間順序開啟和關(guān)閉，稱階段特異性階段特異性*哺乳類哺乳類nAChR： 胚胎型胚胎型2(煙堿型乙酰膽堿受體煙堿型乙酰膽堿受體) 成年型成年型216 組織特異性組織特異性 （空間特異性）（空間特異性）在個體生長的某一階段，在個體生長的某一階

8、段， 不同細胞有不同不同細胞有不同基因表達基因表達胰島素：胰島胰島素：胰島 細胞細胞血紅蛋白：紅細胞血紅蛋白：紅細胞鳥氨酸循環(huán)酶類：肝細胞鳥氨酸循環(huán)酶類：肝細胞X YX Y AB17四、基因表達的方式四、基因表達的方式 有些基因的產(chǎn)物對于生物體的整個生命過程都是必不可有些基因的產(chǎn)物對于生物體的整個生命過程都是必不可少的，這類基因在生物體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，少的，這類基因在生物體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，這類基因被稱為這類基因被稱為管家基因。管家基因。這類基因的表達稱為這類基因的表達稱為基本的基本的基因表達基因表達* 。例如：葡萄糖酵解途徑中各種酶的編碼基因例如：葡萄糖酵解途徑中各種酶的編

9、碼基因基本的基因表達也是在一定機制控制下進行基本的基因表達也是在一定機制控制下進行（一）基本的基因表達（一）基本的基因表達18（二）可調(diào)節(jié)的基因表達（二）可調(diào)節(jié)的基因表達 與管家基因不同，另一些基因表達狀況極易受外與管家基因不同，另一些基因表達狀況極易受外環(huán)境變化的影響，隨外環(huán)境變化，這類基因表達水平環(huán)境變化的影響，隨外環(huán)境變化，這類基因表達水平可升高或降低可升高或降低,又稱又稱適應性表達適應性表達；又稱；又稱奢侈基因奢侈基因。 特點：不是細胞生命必不可少的特點：不是細胞生命必不可少的 表達受外環(huán)境的影響較大，不恒定表達表達受外環(huán)境的影響較大，不恒定表達 有間斷性和空間特異性有間斷性和空間特異

10、性 19 誘導誘導 基因表達水平在特定環(huán)境中增高的現(xiàn)象基因表達水平在特定環(huán)境中增高的現(xiàn)象 這類基因叫這類基因叫可誘導基因可誘導基因阻遏阻遏基因?qū)Νh(huán)境信號應答表現(xiàn)為表達水平降低基因?qū)Νh(huán)境信號應答表現(xiàn)為表達水平降低這類基因叫這類基因叫可阻遏基因可阻遏基因 DNA損傷：損傷：DNA損傷修復酶被誘導損傷修復酶被誘導 色氨酸供應充足：參與合成色氨酸的酶被阻遏色氨酸供應充足：參與合成色氨酸的酶被阻遏20五五.基因表達的多級調(diào)控基因表達的多級調(diào)控基因表達調(diào)控在多級水平上進行基因表達調(diào)控在多級水平上進行基因激活基因激活 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始* 轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運轉(zhuǎn)錄后加工及轉(zhuǎn)運 mRNA降解降解 翻譯及翻譯后加工翻

11、譯及翻譯后加工 蛋白質(zhì)降解蛋白質(zhì)降解21六、基因表達調(diào)控原理六、基因表達調(diào)控原理以以mRNA轉(zhuǎn)錄為例轉(zhuǎn)錄為例DNA元件元件 調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白RNA聚合酶活性聚合酶活性*調(diào)控要素調(diào)控要素（一）轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)基因表達（一）轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)基因表達22 （1） DNA元件：元件：具有調(diào)節(jié)功能的特異具有調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列序列操縱子：操縱子：由功能上相關(guān)的一組酶或蛋白質(zhì)基因在染由功能上相關(guān)的一組酶或蛋白質(zhì)基因在染色體上串聯(lián)一起并共同享用同一表達調(diào)控的色體上串聯(lián)一起并共同享用同一表達調(diào)控的DNA組組件所構(gòu)成的一個轉(zhuǎn)錄單位。件所構(gòu)成的一個轉(zhuǎn)錄單位。操縱子操縱子調(diào)節(jié)序列調(diào)節(jié)序列編碼序列：編碼蛋白質(zhì)編碼序列：編

12、碼蛋白質(zhì)啟動序列：結(jié)合啟動序列：結(jié)合RNA聚合酶聚合酶操縱序列：結(jié)合阻遏蛋白操縱序列：結(jié)合阻遏蛋白*1、原核生物、原核生物23 操縱子操縱子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)編碼序列編碼序列 啟動序列啟動序列 操縱序列操縱序列其他調(diào)節(jié)序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)24 原核生物啟動序列（啟動子）原核生物啟動序列（啟動子）RNA轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始-35區(qū)區(qū)-10區(qū)區(qū)TTGACATTAACTTTTACATATGATTTTACATATGTTTTGATATATAATCTGACGTACTGTN17N16N17N16N16N7N7N6N7N6AAAAAtrp tRNAT

13、yrlacrecAAra BAD TTGACA TATAAT一致序列一致序列25 （2）調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白特異因子特異因子 決定決定RNA聚合酶特異識別并結(jié)合聚合酶特異識別并結(jié)合 啟動序列的能力啟動序列的能力（因子）因子）阻遏蛋白阻遏蛋白 與操縱序列結(jié)合，抑制與操縱序列結(jié)合，抑制RNA聚合酶活性聚合酶活性 （負性調(diào)節(jié)）（負性調(diào)節(jié)）激活蛋白激活蛋白 促進促進RNA聚合酶活性聚合酶活性（正性調(diào)節(jié)）（正性調(diào)節(jié)）26 （3） RNA聚合酶活性聚合酶活性 DNA元件元件與與調(diào)節(jié)蛋白調(diào)節(jié)蛋白對轉(zhuǎn)錄激活的對轉(zhuǎn)錄激活的調(diào)節(jié)作用最終由調(diào)節(jié)作用最終由RNA聚合酶活性聚合酶活性體現(xiàn)。體現(xiàn)。 啟動序列或啟動子的結(jié)構(gòu)、調(diào)

14、節(jié)蛋白啟動序列或啟動子的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)蛋白的性質(zhì)對的性質(zhì)對RNA聚合酶活性影響最大。聚合酶活性影響最大。 272. 真核生物真核生物（1） 順式作用元件：順式作用元件：（2） 反式作用因子：反式作用因子： （3） mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)28第二節(jié)第二節(jié) 原核基因表達調(diào)控與原核基因表達調(diào)控與真核基因表達調(diào)控的基本原理真核基因表達調(diào)控的基本原理29一、原核基因表達及其調(diào)控的特點一、原核基因表達及其調(diào)控的特點 1、轉(zhuǎn)錄與翻譯兩過程緊密偶聯(lián)、轉(zhuǎn)錄與翻譯兩過程緊密偶聯(lián) 3、操縱子調(diào)節(jié)機制中普遍存在阻遏蛋白介導、操縱子調(diào)節(jié)機制中普遍存在阻遏蛋白介導 的負性調(diào)節(jié)的負性調(diào)節(jié)*2、普遍存在操縱子調(diào)

15、節(jié)機制、普遍存在操縱子調(diào)節(jié)機制阻遏蛋白阻遏蛋白操縱序列操縱序列結(jié)合結(jié)合阻遏阻遏解聚解聚結(jié)合結(jié)合去阻遏去阻遏 阻礙阻礙30 4、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為多順反子mRNA 5、轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄起始是基因表達調(diào)控的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)是基因表達調(diào)控的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)*多順反子多順反子mRNA：多個功能相關(guān)的基因串聯(lián)，多個功能相關(guān)的基因串聯(lián)， 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在 一條一條mRNA上，翻譯產(chǎn)物為多個多肽鏈上，翻譯產(chǎn)物為多個多肽鏈31二、操縱子理論二、操縱子理論通常一個操縱子含有通常一個操縱子含有一個啟動序列及數(shù)個編碼基一個啟動序列及數(shù)個編碼基因因（26個，甚至更多），還有其它調(diào)節(jié)序列。個，甚至更多），還有其它調(diào)節(jié)序

16、列。 編碼序列編碼序列 啟動序列啟動序列 操縱序列操縱序列其他調(diào)節(jié)序列其他調(diào)節(jié)序列(promoter)(operator)PO(coding sequence)操縱子操縱子結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)32乳糖操縱子乳糖操縱子調(diào)節(jié)機制調(diào)節(jié)機制 阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié) CAP的正性調(diào)節(jié)的正性調(diào)節(jié) 協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)33 乳糖操縱子結(jié)構(gòu)乳糖操縱子結(jié)構(gòu) CAP結(jié)合位點結(jié)合位點P IIPOZYA調(diào)控區(qū)調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因I: 阻遏蛋白編碼基因阻遏蛋白編碼基因PI: 阻遏蛋白基因啟動序列阻遏蛋白基因啟動序列Z: -半乳糖苷酶半乳糖苷酶Y: 透酶透酶A: 乙?；D(zhuǎn)移酶乙酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)基因結(jié)構(gòu)基因O:操縱序列操縱序

17、列（阻遏蛋白結(jié)合部位）（阻遏蛋白結(jié)合部位）P:啟動序列啟動序列CAP結(jié)合位點結(jié)合位點調(diào)控區(qū)調(diào)控區(qū)34 1. 阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)（無乳糖）（無乳糖） *阻遏蛋白與阻遏蛋白與O序列結(jié)合序列結(jié)合, 抑制轉(zhuǎn)錄抑制轉(zhuǎn)錄, lac操縱子關(guān)閉操縱子關(guān)閉阻遏蛋白阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點結(jié)合位點P IIPOZYARNA聚合酶聚合酶 35 誘導劑結(jié)合于阻遏蛋白，阻遏蛋白與誘導劑結(jié)合于阻遏蛋白，阻遏蛋白與O序列序列解離，轉(zhuǎn)錄抑制解除，解離，轉(zhuǎn)錄抑制解除，lac操縱子開啟操縱子開啟乳糖乳糖別乳糖別乳糖CAP結(jié)合位點結(jié)合位點P IIPOZYAmRNA 阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)阻遏蛋白的負性調(diào)節(jié)（有乳糖

18、）（有乳糖） * 36 CAP: 分解代謝基因激活蛋白分解代謝基因激活蛋白 catabolite gene activator protein同二聚體同二聚體cAMP 結(jié)合區(qū)結(jié)合區(qū) DNA 結(jié)合區(qū)結(jié)合區(qū)37 2. CAP的正性調(diào)節(jié)的正性調(diào)節(jié)（無葡萄糖）（無葡萄糖） *cAMPCAP蛋白蛋白P IIPOZYACAP結(jié)合位點結(jié)合位點mRNA無葡萄糖，無葡萄糖，cAMP濃度高濃度高cAMP與與CAP結(jié)合結(jié)合 與與CAP結(jié)合位點結(jié)合結(jié)合位點結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性提高約轉(zhuǎn)錄活性提高約50倍倍 38 CAP的正性調(diào)節(jié)的正性調(diào)節(jié)（有葡萄糖）（有葡萄糖） *cAMPCAP蛋白蛋白P IIPOZYACAP結(jié)合位點結(jié)合位點

19、mRNA有葡萄糖，有葡萄糖，cAMP濃度低濃度低cAMP與與CAP結(jié)合受阻結(jié)合受阻轉(zhuǎn)錄活性下降轉(zhuǎn)錄活性下降 39 阻遏蛋白阻遏蛋白mRNACAP結(jié)合位點結(jié)合位點P IIPOZYARNA聚合酶聚合酶 3. 阻遏蛋白與阻遏蛋白與CAP的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)*（1）無乳糖時）無乳糖時, 阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄，阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄， CAP無作用無作用40 （2） 有乳糖時有乳糖時, 乳糖操縱子去阻遏乳糖操縱子去阻遏, 雖可轉(zhuǎn)雖可轉(zhuǎn) 錄錄, 但活性很低但活性很低, 必須由必須由CAP的正性調(diào)節(jié)來加強的正性調(diào)節(jié)來加強P IIPOZYACAP結(jié)合位點結(jié)合位點mRNA 41 乳糖操縱子乳糖操縱子強強的轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄活

20、性既需要乳糖存在既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖又需要缺乏葡萄糖42（一）真核基因結(jié)構(gòu)特點（一）真核基因結(jié)構(gòu)特點 1. 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為單順反子 一個基因一個基因 一條一條mRNA 一條多肽鏈一條多肽鏈2. 重復序列重復序列 高度重復序列、中度重復序列、單拷貝序列高度重復序列、中度重復序列、單拷貝序列3. 基因不連續(xù)性基因不連續(xù)性 非編碼序列非編碼序列 內(nèi)含子內(nèi)含子12353三、真核基因表達調(diào)控三、真核基因表達調(diào)控43 （二）（二） 真核基因轉(zhuǎn)錄特點真核基因轉(zhuǎn)錄特點活性染色體結(jié)構(gòu)變化活性染色體結(jié)構(gòu)變化 對核酸酶敏感、甲基化程度降低、對核酸酶敏感、甲基化程度降低、 組蛋白乙?；藿M蛋白

21、乙?；揎楋?. 正性調(diào)節(jié)占主導正性調(diào)節(jié)占主導 真核真核RNA聚合酶對啟動子的親和力極小或根本沒有聚合酶對啟動子的親和力極小或根本沒有 實質(zhì)的親和力，轉(zhuǎn)錄起始需依賴多種激活蛋白的作用實質(zhì)的親和力，轉(zhuǎn)錄起始需依賴多種激活蛋白的作用3轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進行轉(zhuǎn)錄與翻譯分隔進行 轉(zhuǎn)錄在核內(nèi)進行，翻譯在胞漿進行轉(zhuǎn)錄在核內(nèi)進行，翻譯在胞漿進行44 轉(zhuǎn)錄（起始）調(diào)節(jié)實質(zhì)上是調(diào)節(jié)蛋白與轉(zhuǎn)錄（起始）調(diào)節(jié)實質(zhì)上是調(diào)節(jié)蛋白與DNA的相互作用的相互作用 1、順式作用元件：順式作用元件：2、反式作用因子：反式作用因子： 3、mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)（三）真核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)（三）真核基因轉(zhuǎn)錄激活調(diào)節(jié)45 1

22、. 順式作用元件順式作用元件* 指結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)或內(nèi)部具有調(diào)節(jié)功能的指結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)或內(nèi)部具有調(diào)節(jié)功能的DNA序列，因其作用于自身分子并發(fā)揮作用，序列，因其作用于自身分子并發(fā)揮作用，所以稱所以稱順式作用元件。順式作用元件。 根據(jù)位置、性質(zhì)及作用方式的不同分為根據(jù)位置、性質(zhì)及作用方式的不同分為啟動子、增強子和抑制子。啟動子、增強子和抑制子。46 真核生物真核生物 順式作用元件順式作用元件結(jié)構(gòu)基因序列結(jié)構(gòu)基因序列 啟動子啟動子(promoter)P 抑制子抑制子(silencer) 增強子增強子(enhancer) 增強子增強子(enhancer)47RNA聚合酶聚合酶II啟動位點周圍一啟動位點周圍一

23、 組轉(zhuǎn)錄控制組件組轉(zhuǎn)錄控制組件常見組件：常見組件： TATA盒盒（TATAAA） -25bp -30bp GC盒盒 （GGGCGG） CAAT盒盒（CCAATC）CAAT盒盒GC盒盒TATA盒盒轉(zhuǎn)錄起始點轉(zhuǎn)錄起始點-30bp -110bp啟動子啟動子 promoter48 增強子增強子* ： 遠離轉(zhuǎn)錄起始點、決定組織特異性表達、增強啟動子轉(zhuǎn)遠離轉(zhuǎn)錄起始點、決定組織特異性表達、增強啟動子轉(zhuǎn) 錄活性的特異錄活性的特異DNA序列，其發(fā)揮作用的方式與方向、距序列，其發(fā)揮作用的方式與方向、距 離無關(guān)。離無關(guān)。 抑制子抑制子* ： 對啟動子轉(zhuǎn)錄活性起抑制作用的對啟動子轉(zhuǎn)錄活性起抑制作用的 DNA序列序列

24、負性調(diào)節(jié)元件負性調(diào)節(jié)元件49 2、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子）、反式作用因子（轉(zhuǎn)錄因子） 轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白u 基本轉(zhuǎn)錄因子基本轉(zhuǎn)錄因子u 轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子u 轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)錄抑制因子 50 絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子屬于絕大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子屬于反式作用因子反式作用因子*真核生物：真核生物：由某一基因表達后，通過由某一基因表達后，通過DNA-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用控制另一基因的轉(zhuǎn)錄。蛋白質(zhì)相互作用控制另一基因的轉(zhuǎn)錄。51 AB52 RNA聚合酶結(jié)合啟動子所必須的一組轉(zhuǎn)錄因子聚合酶結(jié)合啟動子所必須的一組轉(zhuǎn)錄因子u 基本轉(zhuǎn)錄因子基本

25、轉(zhuǎn)錄因子FEBDARNA pol TATADNATATA TFD TFA TFB TFF TFERNA pol53 u 轉(zhuǎn)錄激活因子轉(zhuǎn)錄激活因子 （正性調(diào)節(jié)因子）（正性調(diào)節(jié)因子） 通過通過DNA蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用起蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用起 正性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。正性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。u 轉(zhuǎn)錄抑制因子轉(zhuǎn)錄抑制因子 （負性調(diào)節(jié)因子）（負性調(diào)節(jié)因子） 通過通過DNA蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用起負蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用起負 性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子。與增強子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子與增強子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子與抑制子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子與抑制子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子54真核真核RNA聚

26、合酶聚合酶II不能單獨識別啟動子，而是由基本不能單獨識別啟動子，而是由基本轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子TFIID識別并結(jié)合啟動子，形成識別并結(jié)合啟動子，形成TFIID啟動啟動子復合物，然后有一系列的轉(zhuǎn)錄因子（如子復合物，然后有一系列的轉(zhuǎn)錄因子（如TFIIA、TFIIB、TFIIE、TFIIF等）加入形成前起始復合物，等）加入形成前起始復合物，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始。調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的起始。3mRNA轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活及其調(diào)節(jié)55第三節(jié)第三節(jié) 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)56基因重組（基因重組（genetic recombination） 自然發(fā)生的基因重排自然發(fā)生的基因重排 真核、原核均會發(fā)生真核、原核均會發(fā)生 基因變異

27、、物種演變、生物進化的基礎(chǔ)基因變異、物種演變、生物進化的基礎(chǔ)基因工程（基因工程（genetic engineering）重組）重組DNA技術(shù)技術(shù)人工進行基因重組人工進行基因重組57 克隆克隆*(名詞名詞)：就是指來自同一母本的所有副本或就是指來自同一母本的所有副本或 拷貝的集合。拷貝的集合。 克隆化（動詞）：克隆化（動詞）：獲取同一拷貝的過程。獲取同一拷貝的過程。二、重組二、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念技術(shù)相關(guān)概念母本母本克隆克隆clonecloning（一）（一） 克隆與克隆化克隆與克隆化58 細胞克隆：細胞克?。?從大量群體細胞中分離出某一種類型細胞，從大量群體細胞中分離出某一種類型細胞， 經(jīng)擴

28、增獲得這樣一類相同的細胞。經(jīng)擴增獲得這樣一類相同的細胞。在分子生物學領(lǐng)域所說的分子克隆專指在分子生物學領(lǐng)域所說的分子克隆專指 DNA克隆克隆(DNA cloning)。 分子克?。悍肿涌寺。?從眾多不同的分子群體中分離到的很多相同分子的集合。從眾多不同的分子群體中分離到的很多相同分子的集合。59（二）（二）重組重組DNA技術(shù)技術(shù)* 應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)應用酶學的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)（目的基因或目的（目的基因或目的DNA）與載體）與載體DNA連接成復制子，連接成復制子，然后通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方法導入宿主細胞，生長、然后通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等方法導入宿主細胞，生長、篩選出

29、含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞。轉(zhuǎn)化子細胞經(jīng)篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞。轉(zhuǎn)化子細胞經(jīng)擴增、提取，獲得大量目的擴增、提取，獲得大量目的DNA的無性繁殖系，即的無性繁殖系，即DNA克隆，基因工程?？寺?，基因工程。 60 目的目的 DNA 載體載體DNA連接連接復制子（重組復制子（重組DNA）導入宿主細胞導入宿主細胞 （轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）（轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染）轉(zhuǎn)化子細胞轉(zhuǎn)化子細胞轉(zhuǎn)化子細胞擴增，可獲得大量重組轉(zhuǎn)化子細胞擴增，可獲得大量重組DNA 61 基因克隆基因克隆DNA 克隆克隆重組重組DNA同一概念同一概念生物技術(shù)工程生物技術(shù)工程基因工程、細胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程基因工程、細胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程 獲

30、得獲得DNA的無性繁殖系的無性繁殖系 獲得目的基因的表達產(chǎn)物獲得目的基因的表達產(chǎn)物重組重組DNA的目的的目的 62（三）（三） 工具酶工具酶限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶連接酶連接酶DNA聚合酶聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶63 限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶*識別和切割雙鏈識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)部特異核苷酸序列分子內(nèi)部特異核苷酸序列的一類核酸酶。的一類核酸酶。限制性核酸內(nèi)切酶共分三類，基因工程常用限制性核酸內(nèi)切酶共分三類，基因工程常用II類酶，這類酶常識別類酶，這類酶常識別DNA的回文序列的回文序列 * 。64 Hpa I：5- GTT AAC - 3 3- CA

31、A TTG -5平端平端Pst I： 5- CTGCA G - 3 3- G ACGTC -53突出粘性末端突出粘性末端EcoRI：5- G AATT C - 3 3- C TTAA G -55突出粘性末端突出粘性末端65 （四）目的基因（四）目的基因 target genecDNA (complementary DNA) 在體外以在體外以RNA（通常為（通常為mRNA）為模板，）為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的單鏈DNA?；蚪M基因組DNA(genomic DNA) 代表一個細胞或生物體整套遺傳信息的代表一個細胞或生物體整套遺傳信息的所有所有DNA序列。序列。目的基因又稱外源目的基因

32、又稱外源DNA66 攜帶外源攜帶外源DNA，實現(xiàn)外源，實現(xiàn)外源DNA無性繁殖或表達有意義的無性繁殖或表達有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。分子。 常用載體：常用載體： 質(zhì)粒質(zhì)粒 噬菌體噬菌體DNA 病毒病毒DNA質(zhì)粒質(zhì)粒 （1）雙鏈環(huán)狀）雙鏈環(huán)狀DNA，細菌染色體外，細菌染色體外 （2）2 - 3kb 或或 數(shù)百數(shù)百kb （3）獨立自主復制，穩(wěn)定遺傳）獨立自主復制，穩(wěn)定遺傳 （4）遺傳標志）遺傳標志 (五五) 基因載體基因載體 （克隆載體）（克隆載體）67三、重組三、重組DNA技術(shù)技術(shù)的原理的原理 與基本過程與基本過程*1. 獲取目的基因獲取目的基因2. 選擇、構(gòu)建基因載

33、體選擇、構(gòu)建基因載體3. 目的基因與載體連接，形成重組分子目的基因與載體連接，形成重組分子4. 重組分子導入受體細胞重組分子導入受體細胞5. 篩選、擴增篩選、擴增6. 表達目的基因表達目的基因68 +載體載體目的基因目的基因重組重組DNA分子分子細菌細菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染擴增擴增篩選篩選69（1） 化學合成化學合成 （4） PCR（2） 基因組基因組DNA文庫文庫 （3） cDNA文庫文庫 1. 獲取目的基因獲取目的基因70 組織或細胞染色體組織或細胞染色體 限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶多個多個DNA片段片段載體載體多種轉(zhuǎn)化子多種轉(zhuǎn)化子 （基因文庫）（基因文庫）重組重組DNA 導入宿主細胞導入宿

34、主細胞mRNA逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄cDNAcDNA文庫文庫71聚合酶鏈式反應（聚合酶鏈式反應（PCR） 在有特定模板、特異在有特定模板、特異DNA引物及合成引物及合成DNA所需要的所需要的dNTP存在時，向存在時，向DNA合成體系內(nèi)加入耐熱的合成體系內(nèi)加入耐熱的DNA聚合聚合酶（酶（如如Taq DNA聚合酶聚合酶* ），經(jīng)反復變性、退火及延），經(jīng)反復變性、退火及延伸的多個循環(huán)反應，生成特異伸的多個循環(huán)反應，生成特異DNA產(chǎn)物的過程。產(chǎn)物的過程。 72 變性：變性：解開模板雙鏈解開模板雙鏈DNA 95 退火：退火：使引物與單鏈模板使引物與單鏈模板DNA結(jié)合結(jié)合 55 延伸：延伸：DNA鏈的合成鏈的合成 72 73 2. 克隆載體的選擇與構(gòu)建克隆載體的選擇與構(gòu)建 目的基因不能自我復制目的基因不能自我復制 3. 目的基因與載體連接（目的基因與載體連接（DNA連接酶連接酶* ）重組重組DNA4. 重組重組DNA導入受體菌導入受體菌安全菌安全菌 感受態(tài)感受態(tài)導入方式：轉(zhuǎn)化導入方式：轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染 感染感染74 5. 重組體的篩選重組體的篩選（1）直接選擇法）直接選擇法 抗藥性標志選擇抗藥性標志選擇 ampr tetr kanr 標志補救標志補救 互補互補 分子雜交