質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌（課堂PPT）

1、1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌大腸桿菌21、重組質(zhì)粒的鑒定 當(dāng)質(zhì)粒的重組或其他載體重組后，通常會(huì)發(fā)生質(zhì)粒的重組失敗，包括質(zhì)粒的本身環(huán)化。因而要求進(jìn)行篩選，把重組成功的質(zhì)粒找出來(lái)。 在目前常用的質(zhì)粒和其他載體中含有相應(yīng)的抗生素抗性基因，若重組成功，或不含質(zhì)粒的自身環(huán)化，抗生素抗性基因表達(dá)，被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌便具備抵抗相應(yīng)抗生素的能力，可以在含該抗生素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)傳代。若重組失敗，大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。2、為擴(kuò)增質(zhì)粒和其他載體作準(zhǔn)備 由于大腸桿菌繁殖快，在適宜的條件下繁殖一代僅需要20-30min，而且常用質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌中增殖達(dá)到幾百個(gè)拷貝。因此，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌培養(yǎng)，可以在短

2、時(shí)間內(nèi)極大的擴(kuò)增目的質(zhì)粒。一、實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康哪康?二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 通過(guò)CaCl2對(duì)特定的大腸桿菌處理，制備感受態(tài)的細(xì)菌。這些細(xì)菌可使每微克超螺旋質(zhì)粒DNA，如一些插入目的DNA片段的重組質(zhì)粒，產(chǎn)生51062107個(gè)轉(zhuǎn)化的菌落。 當(dāng)質(zhì)粒與這些大腸桿菌混合后，質(zhì)粒粘附在大腸桿菌的表面，在42時(shí)，大腸桿菌出現(xiàn)熱休克，質(zhì)?？赏ㄟ^(guò)大腸桿菌細(xì)胞膜上形成的空隙進(jìn)入菌體內(nèi)。隨后，加入LB培養(yǎng)液，于37振動(dòng)培養(yǎng)可使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因，提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化成功的大腸桿菌可以在相應(yīng)抗生素培養(yǎng)皿中傳代，形成菌落。4三、實(shí)驗(yàn)流程：三、實(shí)驗(yàn)流程：滅活滅活物物/ /質(zhì)粒質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化

3、大腸桿菌挑菌挑菌搖菌搖菌菌液菌液PCRPCR5四、實(shí)驗(yàn)方法四、實(shí)驗(yàn)方法-凍融法凍融法連接產(chǎn)物滅活連接產(chǎn)物滅活7 700，10min10min（冰上解凍）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（冰上解凍）大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞5 50 0l l、滅火物滅火物1010l l混合物，冰上放置混合物，冰上放置3 30min0min42,42,9 90sec0sec冰上冰上2min2min加入加入10001000ulLBulLB液體（無(wú)抗）液體（無(wú)抗）3737，振蕩，振蕩1h1h離心離心10000rpm,1min,RT10000rpm,1min,RT去上清去上清800800l l留下留下200200l l上清于上清于1.5ul

4、1.5ul離心管中重懸離心管中重懸涂板涂板3737恒溫箱，倒置培養(yǎng)恒溫箱，倒置培養(yǎng)12h(12h(時(shí)間不得超過(guò)時(shí)間不得超過(guò)20h)20h)61、無(wú)菌落，失敗，或培養(yǎng)條件不充分。2、菌落布滿如苔樣，失敗，可能是抗生素濃度不夠或失效。3、菌落布滿，抗生素濃度太高，失敗。4、出現(xiàn)菌落，符合要求。（1）（2）（3）（4）7五、結(jié)果分析和失敗原因五、結(jié)果分析和失敗原因（1）有菌落，說(shuō)明轉(zhuǎn)化成功，但有兩種可能性：其一，質(zhì)粒自身環(huán)化；其二，重組成功。（2）無(wú)菌落，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)沒(méi)成功。（3）菌落布滿如苔樣，可能是抗生素濃度不夠或失效。（4）出現(xiàn)大菌斑，大多數(shù)是霉菌污染所致。1 1、結(jié)果分析、結(jié)果分析81、平板中的

5、抗生素部分失效，長(zhǎng)出的克隆是雜菌。2、倒Ka平板時(shí)，培養(yǎng)基太燙，應(yīng)冷卻到50以下加Ka抗生素。2、涂板時(shí)來(lái)回用力過(guò)大，涂布環(huán)或者涂布棒灼燒過(guò)熱，或不待冷卻就涂布。3、感受態(tài)細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處在常溫狀態(tài)，會(huì)嚴(yán)重影響其轉(zhuǎn)化，操作時(shí)動(dòng)作迅速。4、操作時(shí)動(dòng)作過(guò)于劇烈，減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。切記感受態(tài)細(xì)胞比較嬌嫩。5、操作過(guò)程不規(guī)范，染菌。2 2、轉(zhuǎn)化失敗的原因、轉(zhuǎn)化失敗的原因9六、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備六、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備（1 1）從從LBLB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E.coliE.coli TOP10TOP10單菌落單菌落于于50ml LB50ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，3737振

6、蕩過(guò)夜；振蕩過(guò)夜；（2 2）將該菌懸液以）將該菌懸液以1:100-1:501:100-1:50的比例接種于的比例接種于100ml LB100ml LB液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基中，3737振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)2-32-3小時(shí)至小時(shí)至OD600OD6000.50.5左右；左右；（3 3）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置）將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上放置1010分鐘，然后于分鐘，然后于44下下4100rpm4100rpm離離心心1010min。（4 4）棄掉上清）棄掉上清, ,加入加入3 30ml0.1mol/L預(yù)冷的預(yù)冷的CaClCaCl2 2 溶液，重懸，冰上放置溶液，重懸，冰上放置15-30min15

7、-30min后，后，44下下41004100rpm離心離心1010min；（5 5）棄掉上清，加入）棄掉上清，加入2ml2ml預(yù)冷的預(yù)冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaClCaCl，加入無(wú)菌甘油，加入無(wú)菌甘油300300l，重懸混勻重懸混勻, ,冰上放置幾分鐘；冰上放置幾分鐘；（6 6）分裝，每管）分裝，每管100l100l，液氮冷凍后，液氮冷凍后, ,保存于保存于-70-70冰箱。冰箱。 10七、挑菌、搖菌七、挑菌、搖菌 （1）離心管標(biāo)號(hào)（2）每個(gè)管內(nèi)吸入650l l LB+Ka 抗生素（3）用牙簽挑取單個(gè)菌（4）搖床上搖菌（時(shí)間大于8h）準(zhǔn)備：離心管、牙簽、鑷子、LB+抗生素11

8、八、八、藍(lán)白斑篩選原理藍(lán)白斑篩選原理 藍(lán)白斑篩選-篩選重組子：根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如-互補(bǔ)、抗生素基因等。 現(xiàn)在許多載體都含有一個(gè)大腸桿菌DNA的短區(qū)段，其中有-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS）。 受體菌則含編碼-半乳糖苷酶C端aa的序列。當(dāng)外源基因插入時(shí)，二者溶為一體后，有-半乳糖苷酶表達(dá)，在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷（X-gal）培養(yǎng)基中形成藍(lán)色菌落。 而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn)，從而造成插入失活，而使lacZ基因不表達(dá)而形成白色菌斑。通過(guò)顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。12 藍(lán)白斑篩選：（1）未轉(zhuǎn)化的菌不具有抗性，不生長(zhǎng)；（2）轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒的菌，長(zhǎng)成藍(lán)色菌落；（3）轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，即目的重組菌，長(zhǎng)成白色菌落。13九、菌液九、菌液PCRPCR驗(yàn)證驗(yàn)證 加樣：