BMPbFGF生物活性材料修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)研究

1、BMP/bFGF生物活性材料修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷的實(shí)驗(yàn)研究         10-05-05 14:52:00     編輯：studa20                     作者：林佳聲，趙承斌，李華哲【摘要】  目的探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogen

2、etic protein,BMP)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)生物材料在關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)過(guò)程中的作用,為內(nèi)源性修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法取24只14齡成年大白兔隨機(jī)分成4組，每只動(dòng)物于雙側(cè)膝關(guān)節(jié)股骨臏股關(guān)節(jié)面制備直徑5mm全層關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。鉆通骨髓腔。A組應(yīng)用BMP/ bFGF生物活性材料，B組應(yīng)用BMP生物活性材料，C組應(yīng)用bFGF生物活性材料，D組單純應(yīng)用生物蛋白膠材料。于8、12、24周在大體，光鏡及電鏡下觀察損傷修復(fù)效果，組織學(xué)評(píng)分。 結(jié)果A組于8、12周時(shí)，軟骨缺損被白色半透明堅(jiān)硬組織平滑修復(fù)，富有光澤

3、，24周時(shí)修復(fù)組織正常軟骨邊界模糊，連接緊密，質(zhì)地堅(jiān)硬，表面平滑光潤(rùn)。B、C組于8、12、24周時(shí)候均未見(jiàn)軟骨缺損完全修復(fù)，邊界清楚，中央凹陷明顯殘留。D組全程均未見(jiàn)軟骨修復(fù)。組織學(xué)平分A組明顯優(yōu)于B、C、D組，而B(niǎo)、C組之間無(wú)差別。結(jié)論BMP/bFGF生物活性材料可以有效修復(fù)兔大面積關(guān)節(jié)軟骨損傷，療效明顯優(yōu)于單獨(dú)應(yīng)用骨形態(tài)發(fā)生蛋白或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，為關(guān)節(jié)軟骨損傷治療提供新的治療方法。 【關(guān)鍵詞】  骨形態(tài)發(fā)生蛋白； 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子； 軟骨缺損； 生物蛋白    Abstract：ObjectiveTo study the repair

4、of articular cartilage defects with combined bone morphogenetic protein(BMP)/basic fibroblast growth factor (bFGF) biomaterial in order to supply experimental basis for repairing cartilage defects biologically.MethodTwentyfour 14weekold  rabbits were randomly divided into four groups,BMP/bFGF b

5、iomaterial gel(group A), BMP biomaterial gel (group B), bFGF biomaterial gel(group C) and simple fibrin glue treated group (group D).A couple of  knees of each rabbit experienced 5 mmdiameterfull cartilage resection and drilling throuth of bone marrow.Gross appearance,histologicol section and&#

6、160; electron microscope were axamined at 8,12,24 weeks after operation.ResultIn  group A the cartilage defects were smoothly repaired by white translucent hard tissue at 8 and 12 weeks,and defect boundary was hard to be indentified with normal cartilage at 24 weks. No smooth repairing was obse

7、rvered in B,C and D groups.  Group A got a better histological score than B,C and group D(P<0.05). No difference exited between B and C groups (P>0.05).ConclusionCombined BMP/bFGF biomaterial is good for repair of articular cartilage defects and has better result than using BMP or bFGF al

8、one.These results may provide a therapy for articular cartilage defects.    Key words：bone morphogenetic protein;   fibroblast growth factor;  basic defects of cartilage;  fibrin glue    關(guān)節(jié)軟骨缺損是臨床常見(jiàn)疾病，病人會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)疼痛及運(yùn)動(dòng)障礙，最終引起骨性關(guān)節(jié)炎。 關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)是骨科研究的熱點(diǎn)。目前常用的

9、是外源性修復(fù)方法，如鉆孔術(shù)、骨膜和軟骨膜移植、細(xì)胞移植、骨軟骨移植等，盡管軟骨細(xì)胞移植在理論上更為有利，但依照國(guó)內(nèi)外實(shí)際情況，自體軟骨細(xì)胞回植的治療方法在取材，培養(yǎng)，防止污染和經(jīng)費(fèi)方面都有困難，而且療效也并不完美1。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)軟骨缺損的修復(fù)過(guò)程是一個(gè)多種因子參與的復(fù)雜過(guò)程。所以本研究基于臨床實(shí)際情況，利用有效生物活性材料，為內(nèi)源性軟骨修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)參考。    1   實(shí)驗(yàn)方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料    14周齡哈爾濱大白兔24只，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第

10、一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；醫(yī)用生物蛋白膠， 廣州倍繡生物技術(shù)有限公司；重組人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，美國(guó)invitrogen生物有限公司； 牛天然骨形態(tài)發(fā)生蛋白，天津中津生物發(fā)展有限公司；戊巴比妥鈉， 上?；瘜W(xué)試劑廠。    1.2   BMP和bFGF生物蛋白膠復(fù)合材料的制備2    溶解60 mg/ml纖維蛋白原(50 000 u/ml和500 mg/ml)1 ml，準(zhǔn)備凝血酶原溶液(500 u/ml)1 ml。改進(jìn)共推注射器，控制其微量出液。纖維蛋白原和凝血酶原組通過(guò)“Y”形針頭混合后立即成為固體狀態(tài)。

11、0;   30 mg骨形態(tài)發(fā)生蛋白溶于2 mL 4 mol/L鹽酸胍、10.05 mol/L氯化鈣溶液中,兌水透析24 h，備用。如果需要保存，將稀釋液在-20°C條件下貯存。    先用0.1%胎牛血清蛋白1 ml溶解0.1 mg堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（防止堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子粘附于安瓶?jī)?nèi)），將稀釋液溶解于1 ml Tris液備用。如果需要保存，將稀釋液在-20°C條件下貯存。    1.3   模型制備    1.4  觀察指標(biāo)&

12、#160;   2   結(jié)  果    2.1  BMP/bFGF生物蛋白膠的制備    在20左右的室溫條件下，bFGF及 BMP溶液可以很好的溶解于纖維蛋白原中成為透明液體，與凝血酶混合后，于5 s內(nèi)迅速凝結(jié)，成為固態(tài)膠體。材料白色半透明，富于光澤，質(zhì)地松軟而脆弱，充填于軟骨缺損部可以很好的適應(yīng)軟骨的曲線，并可將修飾得非常平滑。注射過(guò)程應(yīng)該均勻而快速，注于缺損部后待凝膠成型后，注意休整表面與正常關(guān)節(jié)面一致。    2.2  

13、; 大體形態(tài)和一般狀況      所有動(dòng)物均無(wú)膝關(guān)節(jié)感染和積液發(fā)生。A組只，B組只，C組只動(dòng)物跛行（4周左右），關(guān)節(jié)活動(dòng)受限。余所有動(dòng)物均未見(jiàn)跛行，其膝關(guān)節(jié)活動(dòng)范圍較術(shù)前無(wú)明顯改變，表現(xiàn)活躍，食欲佳。大體觀察，A組：軟骨缺損區(qū)均為修復(fù)組織所充填，表面光滑，半透明狀而有光澤。術(shù)后8周修復(fù)組織成白色，質(zhì)地堅(jiān)韌，與周圍組織結(jié)合緊密，但可清楚的顯示界限，表面平滑與關(guān)節(jié)面曲線配合完善；術(shù)后12周修復(fù)組織仍成白色堅(jiān)韌組織，與周圍組織融為一體，邊界趨與模糊，表面更趨平整；術(shù)后24周修復(fù)組織成為白色半透明軟骨樣組織，與周圍軟骨結(jié)合為一體，表面稍微凹陷，關(guān)節(jié)表面平滑，堅(jiān)硬

14、。B組，C組：術(shù)后8、12、24周均未出現(xiàn)完整平滑關(guān)節(jié)面修復(fù)現(xiàn)象，表面凹凸不平，只是在缺損邊緣有部分修復(fù)組織出現(xiàn)，中央缺損長(zhǎng)期存在，被暗紅色疏松結(jié)締組織充填，修復(fù)組織與正常軟骨界限清楚。D組也完全沒(méi)有出現(xiàn)修復(fù)現(xiàn)象出現(xiàn) 。    2.3  組織學(xué)觀察    A組：術(shù)后8周，HE染色見(jiàn)缺損已經(jīng)被明顯修復(fù)，大量軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，圓形和橢形胞核清晰，有軟骨陷凹出現(xiàn)，修復(fù)組織與關(guān)節(jié)缺損邊緣軟骨結(jié)合緊密，PAS染色見(jiàn)基質(zhì)出現(xiàn)藍(lán)染，糖胺多糖類物質(zhì)開(kāi)始大量沉積；術(shù)后12周，修復(fù)組織厚于正常軟骨，修復(fù)組織與其結(jié)合緊密，以類透明軟骨細(xì)胞為主，大量增

15、殖，軟骨陷窩大量出現(xiàn)，表層軟骨細(xì)胞稀疏體積小，而底層細(xì)胞量多且較為巨大，呈現(xiàn)分層分布的特點(diǎn)，基質(zhì)PAS染色見(jiàn)明顯藍(lán)染，糖胺多糖類物質(zhì)沉積更為明顯；術(shù)后24周，軟骨厚度稍變薄，軟骨陷窩明顯，修復(fù)組織與正常軟骨界限模糊，結(jié)合緊密，蛋白多糖類物質(zhì)明顯沉積，部分區(qū)域出現(xiàn)纖維軟骨特點(diǎn)。B組、C組：術(shù)后缺損未被有效修復(fù)，中央凹陷表面長(zhǎng)期殘留，缺損內(nèi)部被大量肉芽組織填充，邊壁出現(xiàn)骨板，基質(zhì)染色見(jiàn)少數(shù)靠近骨板的局部出現(xiàn)軟骨基質(zhì)沉積。D組：8、12、24周術(shù)后軟骨缺損長(zhǎng)期存在，缺損處被大量肉芽組織所填充。質(zhì)地松軟，與周圍無(wú)明顯連接，HE染色未見(jiàn)軟骨細(xì)胞出現(xiàn)，PAS染色未見(jiàn)糖胺多糖類物質(zhì)沉積。 

16、0;  2.4   電鏡下觀察    A組術(shù)后8、12周電鏡下表層可見(jiàn)縱行排列的軟骨細(xì)胞、軟骨囊,軟骨細(xì)胞之間可見(jiàn)間隙及成熟的軟骨基質(zhì)，部分軟骨鈣化；術(shù)后24周組:電鏡下軟骨基質(zhì)膠原排列規(guī)則，軟骨厚度均勻，軟骨下方為排列規(guī)則的骨髓腔（圖111）。    2.5   組織學(xué)評(píng)分    雙盲法測(cè)定，結(jié)果顯示，A組（1.92±0.69）明顯優(yōu)于B組（3.58±0.67），C組(3.33±0.89)及D組(12.45±1.0

17、5)。SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，A組和B 、C 、D 3組均存在顯著性差異(P<0.05) ；B、C、D組存在顯著性差異(P<0.05)；而B(niǎo)組和C組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。    圖1  BMP/bFGF生物活性材料組術(shù)后8周大體觀察  圖2  BMP/bFGF生物活性材料組術(shù)后12周大體觀察  圖3  BMP/bFGF生物活性材料組術(shù)后24周大體觀察  圖4  BMP/bFGF生活活性材料組術(shù)后8周（HE染色×40）  圖5  BMP/bFGF生活活性材料組術(shù)后12周（HE染色×40）  圖6  BMP/bFGF生活活性材料組