去細(xì)胞牛松質(zhì)骨復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔橈骨缺損

1、去細(xì)胞牛松質(zhì)骨復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔橈骨缺損    【摘要】  目的：研制理想的能夠修復(fù)骨缺損的骨材料，為其在骨缺損修復(fù)領(lǐng)域中的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：體 外擴(kuò)增誘導(dǎo)兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，將其與去細(xì)胞牛松質(zhì)骨復(fù)合培養(yǎng)。造成兔橈骨中段 10 mm 骨缺損模型，分復(fù)合細(xì)胞組、單純材料組、空白對(duì)照組。通過(guò)大體觀察、放射學(xué)檢查、組織學(xué)檢查觀察骨缺損的修復(fù)情況。結(jié)果：去細(xì)胞牛松質(zhì)骨復(fù)合骨髓基質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔橈骨缺損，12 周時(shí)缺損區(qū)完全被新骨代替，骨髓腔完全通暢，優(yōu)于單純材料組的修復(fù)效果，單純材

2、料組優(yōu)于空白對(duì)照組。結(jié)論：去細(xì)胞牛松質(zhì)骨具有良好的成骨能力，有可能成為理想的骨支架材料?！娟P(guān)鍵詞】  骨修復(fù)材料；去細(xì)胞牛松質(zhì)骨；組織工程    Abstract    Objective     To  prepare  an  ideal  scaffold  material  for  the

3、0; repair  of  bone  defect,  for  the  clinical  use  in  the  bone  reconstruction  field.    Methods     Rabbit  marr

4、ow  stem  cells  (MSCs)  were  cultured  and  expanded  in  vitro.  The  MSCs  were  mixed  with  acellular  bovine  cancellous

5、60; bone  (ABCB).  The  rabbits  were  prepared  as  model  of  bone  defects,  divided  into  3  groups:named  complex  group, &#

6、160;acellular  bovine  cancellous  bone  group,  and  blank  control.  The  animals  were  sacrificed  and  new  bone  regeneration  in 

7、; the  defects  was  investigated  by  gross  specimen  inspection,  X-ray  examination  and  histological  observation.    Results    

8、 At  12  weeks,  the  radial  defects  repaired  by  named  complex  group,  and  their  marrow  cavities  formed,  which  is

9、  better  than  acellular  bovine  cancellous  bone  group.  Acellular  bovine  cancellous  bone  group  is  better  than  blank  

10、control.    Conclusion     Acellular  bovine  cancellous  bone  may  be  used  as  a  kind  of  ideal  scaffold  material.

11、60;   Key  Words    Bone  repair  material;  Acellular  bovine  cancellous  bone;  Bone  tissue  engineering    研制理想的生物材料替代自體骨移植用于修復(fù)骨組織缺損是醫(yī)學(xué)和生物材料

12、科學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。目前臨床上應(yīng)用的骨移植物較多，如羥基磷灰石、脫鈣骨、脫蛋白骨等為臨床骨缺損的治療提供了很多選擇。但是這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，難以滿足臨床上修復(fù)各種骨缺損的需要。去細(xì)胞牛松質(zhì)骨作為新型的生物衍生支架材料，具有良好的力學(xué)性質(zhì)、空間結(jié)構(gòu)、降解性、生物相容性等特點(diǎn)，日益受到重視。本研究將兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）與去細(xì)胞牛松質(zhì)骨載體相結(jié)合，構(gòu)建組織工程骨，探索修復(fù)兔橈骨節(jié)段性骨缺損的可行性。    1    材料與方法    1.1  &#

13、160; 材料    1.2    方法    2    結(jié)    果    2.1    原代細(xì)胞培養(yǎng)    原代細(xì)胞接種后，細(xì)胞漂浮在培養(yǎng)液表面，呈圓形，細(xì)胞 6 h 后開(kāi)始貼壁，24 h 內(nèi)有少數(shù)細(xì)胞貼壁，48&#

14、160;h 后貼壁細(xì)胞增多，形狀不一。約 6 d 時(shí)形成細(xì)胞集落，約 10 d 后長(zhǎng)滿。1:2 傳代后增殖加快，細(xì)胞呈均一的長(zhǎng)梭形，呈漩渦狀生長(zhǎng)（圖 1）。    2.2    相差顯微鏡觀察    BMSCs 在材料上接種孵育 2 h 后，材料周邊開(kāi)始有細(xì)胞黏附，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，附著材料上的細(xì)胞逐漸增多；培養(yǎng) 1 周后，細(xì)胞在材

15、料上逐漸伸出突起，連接在骨小梁之間，可見(jiàn)大量細(xì)胞附著于材料的孔隙及材料周邊。    2.3    掃描電鏡觀察    可見(jiàn) ABCB 材料上皆有細(xì)胞附著，細(xì)胞呈梭形或多角形，有的細(xì)胞表面可見(jiàn)鈣顆粒沉積，有的材料上的細(xì)胞呈團(tuán)簇狀，周?chē)芯W(wǎng)狀膠原附著。2.4    VON Kossa 染色    顯微鏡下見(jiàn)誘導(dǎo)組細(xì)胞間可見(jiàn)黑色斑點(diǎn)狀被染色的鈣基質(zhì)；未誘導(dǎo)組未見(jiàn)黑

16、色斑點(diǎn)狀被染色的鈣基質(zhì)。    2.5    骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)    3    討    論    理想的骨組織工程細(xì)胞外基質(zhì)材料應(yīng)具有良好的生物相容性和可降解性、合適的三維多孔結(jié)構(gòu)、較強(qiáng)的骨誘導(dǎo)性、良好的可塑性和適當(dāng)?shù)臋C(jī)械強(qiáng)度，尤其是作為管狀骨的修復(fù)材料2。提供移植的材料多種多樣，但理想的骨缺損修復(fù)材料，尤其是修復(fù)大段骨缺損的移植材料仍是骨科面臨的重要課題。

17、異種骨由于來(lái)源廣泛和經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便，在解剖形狀、組織結(jié)構(gòu)等方面具有無(wú)法比擬的優(yōu)越性，一直是骨修復(fù)工作者熱衷于研制開(kāi)發(fā)的植骨材料，然而異種骨的免疫排斥反應(yīng)妨礙植骨與骨缺損區(qū)域直接接觸，破壞植骨成分，導(dǎo)致植骨吸收。    如何消除異種骨的抗原性，同時(shí)保留其成骨能力，是異種骨移植的核心問(wèn)題。羅卓荊3等通過(guò)對(duì)松質(zhì)骨抗原性的研究發(fā)現(xiàn)，在骨小梁骨基質(zhì)染色陰性，而骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨陷窩等均有不同程度的陽(yáng)性染色。也就是說(shuō)，各種細(xì)胞成分是松質(zhì)骨中抗原的主要成分。常用的去細(xì)胞方法有酶消化法、滲透溶液法和去污清洗法。筆者采用 10% 高滲生理鹽水和去

18、污劑 TritonX-100 聯(lián)合對(duì)牛肱骨進(jìn)行組織工程學(xué)的去細(xì)胞處理。去細(xì)胞基質(zhì)骨有效地去除異種骨引起免疫排斥反應(yīng)的細(xì)胞成分，清潔骨陷窩壁，選擇性地保留抗原性相對(duì)較弱的網(wǎng)狀骨基質(zhì)結(jié)構(gòu)，降低了移植骨的免疫原性。    為了尋求理想的修復(fù)材料，課題組采用自制的去細(xì)胞牛骨作為兔骨髓基質(zhì)干細(xì)胞載體復(fù)合移植于體內(nèi)骨缺損處，以觀察其成骨潛能和吸收降解情況，旨在為今后的實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用提供依據(jù)。    MSCs 是骨髓中的一類(lèi)多能干細(xì)胞，具有分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞甚至神經(jīng)細(xì)胞等多種潛能，可

19、在地塞米松、維生素 C、- 甘油磷酸鈉等誘導(dǎo)下向成骨細(xì)胞分化，是構(gòu)建組織工程骨的重要細(xì)胞 。應(yīng)用 MSCs 修復(fù)骨缺損的組織工程方法一般是將 MSCs 與支架材料復(fù)合后植入缺損區(qū)，或先將 MSCs 誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后再與支架材料復(fù)合并植入缺損區(qū)。我們所采用的將 MSCs 誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后和去細(xì)胞牛骨復(fù)合在一起的方法，此前尚未見(jiàn)報(bào)道。    以往的研究發(fā)現(xiàn)：生物衍生骨孔隙率高，可有效地為種子細(xì)胞黏附、分化和成骨提供良好場(chǎng)所。生物衍生骨植入骨缺

20、損區(qū)后，隨著誘導(dǎo)成骨作用、骨傳導(dǎo)作用的完成而逐漸降解，其逐步降解的特點(diǎn)與新骨形成的過(guò)程相吻合。本實(shí)驗(yàn)中將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)后，接種于支架材料上，植入骨缺損處，發(fā)揮其最大成骨活性。在體內(nèi)微循環(huán)環(huán)境影響、應(yīng)力作用及血液供應(yīng)等條件下，組織工程骨可同時(shí)發(fā)揮骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)成骨作用，從而修復(fù)骨缺損。通過(guò)放射學(xué)檢查、大體觀察及組織學(xué)檢查均表明，組織工程骨的成骨及塑形能力較強(qiáng)。4、8 周復(fù)合細(xì)胞組有大量骨痂形成 ，12 周時(shí)骨塑形好，提示組織工程骨成骨較快，新骨塑形、改建迅速；而單純材料組只是通過(guò)支架材料的骨傳導(dǎo)作用促進(jìn)成骨，所以新骨形成較慢；空白對(duì)照組各缺損區(qū)均未愈合。    尋找能同時(shí)滿足生物相容性良好、有利于細(xì)胞黏附生長(zhǎng)、且有一定的孔隙率并具備相當(dāng)?shù)慕到馑俾实纳镏Ъ懿牧鲜墙M織工程的重點(diǎn)。本文作者認(rèn)為用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合去細(xì)胞牛松質(zhì)骨構(gòu)建的組織工程骨移植修復(fù)骨缺損，排斥反應(yīng)少，能促進(jìn)負(fù)重部位長(zhǎng)段骨缺損修復(fù)，此方面的深入研究將為骨組織工程的臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。筆者通過(guò)一系列理化方法處理的去細(xì)胞骨，降低或消除了移植骨的免疫原性，具有良好生物相容性，但仍保留骨的天然屬