流式細(xì)胞儀常用技術(shù)方法)

1、流式細(xì)胞儀常用技術(shù)方法細(xì)胞周期/DNA分析(PI法一、鞘液準(zhǔn)備(至少3L PBS,提前一天準(zhǔn)備0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g; Na2HPO40.24g;調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH調(diào)節(jié),各地蒸餾水的酸堿度不同,加蒸餾水定容至1L,0.22um濾膜過濾后,室溫保存。二、制備一個(gè)陰性對(duì)照來設(shè)定流式細(xì)胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍:沒有染色的細(xì)胞(制備過程如下,僅不加抗體三、實(shí)驗(yàn)步驟1.取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)細(xì)胞,倒去培養(yǎng)液,胰酶適度消化細(xì)胞,用培養(yǎng)液吹打,1000rpm,離心10min棄上清;2.PBS洗2次,加0.5ml吹勻,務(wù)必吹散;3

2、.加入70%預(yù)冷乙醇中(標(biāo)準(zhǔn)做法是將細(xì)胞懸液加入預(yù)冷70%酒精,固定時(shí)可加入Triton X-100以增加膜的通透性封口膜封口,4固定1-2h或過夜(可長(zhǎng)至一個(gè)月;4.1000rpm×10min離心收集細(xì)胞,PBS洗兩次;6.加入Rnase-A約3ul至終濃度50ug/ml,37水浴消化30min;7.加入PI約50ul至終濃度約為5-50ug/ml,室溫避光染色30min;8.用300目濾網(wǎng)過濾,上機(jī)檢測(cè)。細(xì)胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit一、鞘液準(zhǔn)備(至少3L PBS,提前一天準(zhǔn)備0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水

3、中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g; Na2HPO40.24g;調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH調(diào)節(jié),各地蒸餾水的酸堿度不同,加蒸餾水定容至1L,0.22um濾膜過濾后,室溫保存。二、制備一個(gè)陰性對(duì)照來設(shè)定流式細(xì)胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍:沒有染色的細(xì)胞(制備過程如下1-6三、若做DNA倍體分析,需另設(shè)附加對(duì)照管腫瘤細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞的混合管,比例至少為2:1四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 將細(xì)胞消化后,用冷PBS洗細(xì)胞兩次,300g×5min(若細(xì)胞數(shù)過少可提高轉(zhuǎn)速到500g,為減少細(xì)胞損失可用1.5ml離心管離心;2. 棄上清留大約50ul下面的液體防止碰到細(xì)胞團(tuán),加入1m

4、l Buffer Solution并低速混勻細(xì)胞。3. 室溫離心,300g×5min;4. 重復(fù)2、3一次;5. 棄上清留大約50ul下面的液體,加入1ml Buffer Solution 重懸細(xì)胞;6. 計(jì)數(shù)細(xì)胞,用Buffer Solution將細(xì)胞密度調(diào)為1×106個(gè)/ml;7. 染色:B.每管加入250ul Solution A,用手輕拍混勻(勿用漩渦混勻;C.室溫反應(yīng)10min,保留Solution A;D.加入200ul Solution B,輕輕混勻;E.室溫反應(yīng)10min,保留Solution A+B;F.加入200ul冷Solution C,輕輕混勻,黑暗

5、處2-8孵育10min;用50um尼龍網(wǎng)過濾細(xì)胞,加入上樣管上流式分析(3h內(nèi)分析完。淋巴細(xì)胞亞群分析一、鞘液準(zhǔn)備(至少3L PBS,提前一天準(zhǔn)備0.01M的PBS配制方法:800ml蒸餾水中溶解NaCl8.0g;KCl0.2g; Na2HPO40.24g;調(diào)節(jié)pH到7.2-7.4(用HCl或NaOH調(diào)節(jié),各地蒸餾水的酸堿度不同,加蒸餾水定容至1L,0.22um濾膜過濾后,室溫保存。二、制備一個(gè)陰性對(duì)照來設(shè)定流式細(xì)胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范圍:沒有染色的細(xì)胞(制備過程如下,僅不加抗體三、實(shí)驗(yàn)步驟1.采集血液樣品,取100ul抗凝全血加入每支試管中,注意不要碰到管壁。2.輕輕混勻,依次加入20u

6、l Isotype Control(如沒有的話用沒染色細(xì)胞代替,另外幾管加入20l熒光抗體。室溫避光保存20分鐘。3.加入1×紅細(xì)胞溶解液450l,渦旋混勻避光保存10min,待管內(nèi)液體透亮,300-500g離心5min,去上清4.加PBS 2mlPBS渦旋混勻,300-500g離心5min,棄上清,然后加0.5mlPBS搖勻。過300目尼龍網(wǎng),4避光1h內(nèi)上機(jī)檢測(cè);若不能及時(shí)上機(jī),加入0.5ml含1%多聚甲醛的PBS,放4冰箱保存, 48h內(nèi)上機(jī)檢測(cè)。Annexin V/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡(BD公司Annexin-FITC/PI試劑盒細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面,目前早期

7、識(shí)別仍有困難。這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS是一種帶負(fù)電荷的磷脂,正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面,在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使PS暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結(jié)合蛋白,最初發(fā)現(xiàn)是一種具有很強(qiáng)的抗凝血特性的血管蛋白,Annexin V具有易于結(jié)合到磷脂類如PS的特性。對(duì)PS有高度的親和性。因此,該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的PS。PS轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所獨(dú)特的,也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的,而細(xì)胞壞死在其

8、早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此,可以建立一種用Annexin V結(jié)合在細(xì)胞膜表面作為凋亡的指示并結(jié)合一種染料排除試驗(yàn)以檢測(cè)細(xì)胞膜的完整性的檢測(cè)方法。一、鞘液準(zhǔn)備(至少3L PBS,提前一天準(zhǔn)備0.01M 的 PBS 配制方法： 800ml 蒸餾水中溶解 NaCl8.0g； KCl0.2g； Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié) pH 到 7.2-7.4（用 HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié)，各地蒸 餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至 1L，0.22um 濾膜過濾后，室溫 保存。 二、制備三個(gè)質(zhì)控樣本來設(shè)定流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償和設(shè)置十字門 的范圍（可選）： a 沒有染色的細(xì)胞; b 僅用熒光標(biāo)記的 a

9、nnexin V 染色的細(xì)胞; （細(xì)胞先誘導(dǎo)凋亡：42 水浴 10min） c 僅用 PI 染色的細(xì)胞. （一半活細(xì)胞一半乙醇固定的細(xì)胞） 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1.細(xì)胞收集：懸浮細(xì)胞直接收集到 10ml 的離心管中，1000r/min 離心 8min，收集到 1.5ml 離心管，用冷 PBS 洗細(xì)胞兩次，1000r/min 離 心 8min，然后用 1×bind buffer 重懸細(xì)胞，配成樣本細(xì)胞數(shù)為（15） ×106 個(gè)/mL。 2.用 100ul 細(xì)胞懸液（1×105 個(gè) cell）到離心管中。 3.加入 5ulAnnexin V-FITC 和 5ulPI，混勻細(xì)

10、胞，室溫下避光孵育 15min。 4.加入 400ul 1×bind buffer 每管， 用流式細(xì)胞儀分析， 一小時(shí)內(nèi)完成。 結(jié)果判斷：凋亡細(xì)胞對(duì)所有用于細(xì)胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染 性， 壞死細(xì)胞則不能。 細(xì)胞膜有損傷的細(xì)胞的 DNA 可被 PI 著染產(chǎn)生紅 色熒光，而細(xì)胞膜保持完好的細(xì)胞則不會(huì)有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細(xì) 胞凋亡的早期 PI 不會(huì)著染而沒有紅色熒光信號(hào)。 正常活細(xì)胞與此相似。 在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上， 左下象限顯示活細(xì)胞，（FITC-/PI-） 為 ； 右上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（FITC+/PI+），也有認(rèn)為是晚 期凋亡細(xì)胞（認(rèn)為左上象限為壞

11、死細(xì)胞 FITC-/PI+）；而右下象限為凋 亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-）。 Caspase-3-FITC 檢測(cè)細(xì)胞凋亡 （BD 公司 FITC-CONJUGATED MONOCLONAL ACTIVE CASPASE-3 ANTIBODY APOPTOSIS KIT I） 一、鞘液準(zhǔn)備（至少 3L PBS，提前一天準(zhǔn)備） 0.01M 的 PBS 配制方法： 800ml 蒸餾水中溶解 NaCl8.0g； KCl0.2g； Na2HPO40.24g；調(diào)節(jié) pH 到 7.2-7.4（用 HCl 或 NaOH 調(diào)節(jié)，各地蒸 餾水的酸堿度不同），加蒸餾水定容至 1L，0.22um 濾膜過濾后，室溫 保存。 二、制備一個(gè)陰性對(duì)照來設(shè)定流式細(xì)胞儀的取樣參數(shù)和十字門的范 圍： 沒有染色的細(xì)胞（制備過程如下，僅不加抗體） 三、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 將細(xì)胞消化后，用冷 PBS 洗細(xì)胞兩次，1000rpm×8min（若 細(xì)胞數(shù)過少可提高轉(zhuǎn)速到 1500 rpm），用 cytofix/cytopermtm solution 重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為 1×106 個(gè)/0.5ml； 2. 3. 洗兩次； 4. 計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)，按 1×106 個(gè)細(xì)胞加入 100ul Perm/wash TM 冰上孵育細(xì)胞 20min； 吹吸細(xì)胞， 離心， 棄上清， 室溫用 Perm/