第四章 體細胞胚及人工種子

1、體細胞胚及體細胞胚及人工種子人工種子原生質(zhì)體培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)植物細胞、組織體培養(yǎng)及生物反應(yīng)植物細胞、組織體培養(yǎng)及生物反應(yīng)器器植物離體快速繁殖和脫毒培養(yǎng)植物離體快速繁殖和脫毒培養(yǎng)細胞融合細胞融合染色體工程染色體工程轉(zhuǎn)基因植物及食品安全轉(zhuǎn)基因植物及食品安全植物細胞工程及其應(yīng)用植物細胞工程及其應(yīng)用體細胞胚（體細胞胚（somatic embryosomatic embryo）又叫胚狀體，是指離體培）又叫胚狀體，是指離體培養(yǎng)條件下沒有經(jīng)過受精過程而形成的胚胎類似物。養(yǎng)條件下沒有經(jīng)過受精過程而形成的胚胎類似物。胚的發(fā)育圖胚的發(fā)育圖 (A) 伸長期合子；(B) 合子經(jīng)過第一次分裂, 產(chǎn)生1 個頂細胞(綠色)

2、和一個基細胞(粉紅色)；(C) 四分體胚: 頂細胞經(jīng)歷2 次縱向分裂，產(chǎn)生含有4 個細胞的胚體和2 個細胞的胚柄；(D) 16 細胞球形胚: 8 細胞胚的所有細胞經(jīng)過1 次平周分裂, 產(chǎn)生包含8 個細胞的表皮原和8 個細胞的內(nèi)部組織；(E) 早期心形胚；(F) 心形胚: 子葉和胚根原基已經(jīng)出現(xiàn)；(G) 成熟胚胎。 1: 頂細胞; 2 : 基細胞; 3: 胚根原細胞, 形成未來的ROC 和根冠中央?yún)^(qū); RM: 根尖生長點; SM: 莖尖生長點 雙子葉植物的胚胎發(fā)育過程雙子葉植物的胚胎發(fā)育過程花粉培養(yǎng)單細胞懸浮培養(yǎng)原生質(zhì)體培養(yǎng)組織器官培養(yǎng)體細胞胚花粉胚非合子胚非合子細胞合子胚無融合生殖胚*大量研究

3、表明，大多數(shù)植物組織培養(yǎng)，單細胞懸浮培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)中都觀察到體細胞胚胎發(fā)生或花粉胚胎發(fā)生（pollen embryogenesis） *前者為二倍體的體細胞產(chǎn)生的胚狀結(jié)構(gòu) *后者是由小孢子或其分裂產(chǎn)物等單倍體細胞產(chǎn)生的體細胞胚，通常稱花粉胚（pollen embryos），可發(fā)育成單倍體植株。*體細胞胚或花粉胚都是指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細胞，經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的胚狀結(jié)構(gòu)，包括以下幾點含義： 1 1、體細胞胚是組織培養(yǎng)的產(chǎn)物，區(qū)別于無融合生殖的胚，只限于在組織培養(yǎng)范圍使用； 2 2、體細胞胚起源于非合子細胞，區(qū)別于合子胚； 3 3、體體細胞胚細胞胚的形成經(jīng)歷

4、胚胎發(fā)育過程，區(qū)別于組織培養(yǎng)的器官發(fā)生中芽與根的分化。植物體細胞胚胎發(fā)生和誘導(dǎo)器官發(fā)生相比具有明顯的特點： 1、具有兩極性 2、存在生理隔離 3、遺傳性相對穩(wěn)定 4、重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特性 二、體細胞胚胎發(fā)生的方式 *植物組織培養(yǎng)過程中植物體細胞胚胎途徑可歸納為兩類：直接途徑和間接途徑。 *直接途徑是直接從原外植體不經(jīng)愈傷組織階段發(fā)育而成 *間接方式是體胚從愈傷組織或懸浮細胞、有時也從已形成的體胚的一組細胞中發(fā)育而成，如香雪蘭（Freesia refracta）花序外植體經(jīng)直接體細胞胚胎發(fā)生途徑形成再生植株。 *外植體形態(tài)學(xué)極性決定體細胞胚胎發(fā)生，所有體細胞胚都出現(xiàn)在花序軸切段的原形態(tài)學(xué)下端

5、。1 直接途徑 直接發(fā)生體胚的來源細胞可以是外植體表皮、亞表皮、幼胚、懸浮培養(yǎng)的細胞和原生質(zhì)體。 一般認(rèn)為直接方式發(fā)生體胚是由原先就存在于外植體中的胚性細胞預(yù)胚胎決定細胞（PEDCs）培養(yǎng)后直接進入胚胎發(fā)生而形成體胚，如柑桔屬的珠心組織（在體內(nèi)或離體情況）通過預(yù)胚胎決定細胞直接進行體胚發(fā)生的最好例子. 2 間接途徑 間接體細胞胚胎發(fā)生中，外植體已分化的細胞先脫分化，并對其發(fā)育命運重決定而誘導(dǎo)出胚性細胞誘導(dǎo)胚胎決定細胞（IEDCs），進而形成體細胞胚。 1 莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D2 胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)增殖 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D

6、3 由細胞集合體形成體細胞胚 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D 4 體細胞胚萌發(fā)并形成小植株 MS培養(yǎng)基附加1.0mg/L ABA 圖 甘薯品種栗子香胚性愈傷組織誘導(dǎo)體細胞胚和再生小植株 胚性細胞團特征：成簇、成團，體積小，細胞質(zhì)致密三、體細胞胚的起源 *體細胞胚胎發(fā)生途徑有直接途徑和間接途徑，但無論哪一種發(fā)生途徑，絕大多數(shù)研究報道認(rèn)為體細胞胚胎起源于單細胞,從多種植物中都觀察到單個胚性細胞，有不均等分裂的二細胞原胚和均等分裂的二細胞原胚、多細胞原胚、球形胚直到成熟胚。也有研究認(rèn)為起源于多細胞。 *在同一塊愈傷組織或一個胚性細胞復(fù)合體上可以觀察到多個不同發(fā)育時期的體細胞胚，從單個原始細

7、胞到多細胞的原胚、球形胚、魚雷胚直至具子葉的胚狀體，這是由體細胞胚發(fā)生和分裂的不同步所致。 香蕉心形體細胞胚 可可心形胚A和球形胚B A AB B1 1 體細胞胚的單細胞起源體細胞胚的單細胞起源野胡蘿卜的胚狀體 A. 心形期胚狀體 B. 成熟胚狀體 C. 早心形期胚狀體 D. 兩個成熟胚狀體共一個胚柄 a) 胚性細胞第一次分裂； b-d) 原胚第一次細胞分裂，鱷梨樹形胚柄細胞仍保持單個細胞； e) 胚柄細胞開始增殖；f-k) 原胚和胚柄發(fā)育的不同時期； l)球形體細胞胚。 (ep)=原胚； (s)=胚柄圖 仙人掌科體細胞胚胎早期發(fā)育（由單細胞形成球形胚時期）a 胚性葉片愈傷組織；b 球形細胞；

8、c 伸長細胞；d 兩個細胞時期； e 四個細胞時期； f 原胚； g 球形胚；h 心形胚；i 早期魚雷胚； j 成熟魚雷胚； k 不同時期的體細胞胚；l 體細胞胚的萌發(fā)； m 再生小植株。圖 木豆幼苗葉片愈傷組織懸浮培養(yǎng)體細胞胚發(fā)育過程 *有的學(xué)者觀察到體細胞胚來源于多細胞組成的胚性細胞復(fù)合體，王亞馥等人也觀察到這種胚性細胞團，但用同位素脈沖標(biāo)記實驗即可證明這些細胞團也是由一個單細胞連續(xù)分裂而形成，經(jīng)進一步分化和分裂形成不同發(fā)育時期的體細胞胚，因而這些體細胞胚實質(zhì)也可能是起源于單細胞。當(dāng)然也不排除有些植物的體細胞胚的確是起源于多細胞，仍有待深入研究。 *總之，體細胞胚胎的發(fā)生是一個非常復(fù)雜的生

9、理過程，仍有許多問題尚需進一步研究。2 2 體細胞胚的多細胞起源體細胞胚的多細胞起源 四、體細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约毎臋C制 *合子胚來源于受精卵；體細胞胚是非合子胚，未經(jīng)過雌雄配子受精這一過程，Somatic Embryos 又是如何形成？ 機制是什么？*體細胞胚無論起源于哪一種細胞，都存在著一個共同的問題，即體細胞是如何轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约毎纬审w細胞胚的。大量研究事實表明，植物細胞在一定培養(yǎng)條件下，具胚胎發(fā)生能力可能是一個普遍現(xiàn)象。 1 體細胞胚發(fā)生理論漸變理論 （1）體細胞胚胎發(fā)生實質(zhì) *體細胞胚胎發(fā)生實質(zhì)是細胞分化的問題，而細胞分化的分子基礎(chǔ)則是基因差別表達與調(diào)控的結(jié)果。有關(guān)細胞分化的分子機制有許

10、多理論，其中最具普遍性的是漸變理論，認(rèn)為一個細胞系的細胞質(zhì)因子間的互相作用是一個原發(fā)穩(wěn)定基因組中基因活化的結(jié)果，從而使該細胞系與其它細胞系不同。 外植體脫分化愈傷組織細胞分化胚性細胞非胚性細胞基因調(diào)控（2）漸變理論認(rèn)為細胞分化可分為幾個階段？ 分為兩個階段： 第一階段為預(yù)定階段，細胞接受了或預(yù)定了特殊發(fā)育命運，但并未表現(xiàn)出可見的特化標(biāo)志，這種特性一旦建立就可以在細胞繼代培養(yǎng)中得以穩(wěn)定保持。 第二階段是表達階段，在適宜條件誘導(dǎo)下，預(yù)定的細胞（pro-embroygenic determined cells, PEDC）發(fā)生一系列生理生化和形態(tài)上的變化，表現(xiàn)出分化的特性，但由于這種表達與培養(yǎng)過程中

11、誘導(dǎo)因素關(guān)系密切，而表現(xiàn)為一種生理反應(yīng)，是不穩(wěn)定的。（3）漸變理論的不足 （一）未揭示體細胞胚胎發(fā)生的實質(zhì)，以及細胞的預(yù)定性是如何實現(xiàn)的問題。 （二）不能解釋經(jīng)多次繼代培養(yǎng)的細胞往往會失去胚胎發(fā)生能力，因其理論認(rèn)為預(yù)定性細胞在以后的培養(yǎng)過程中處于穩(wěn)定狀態(tài)。 （三）不能解釋體細胞胚胎直接發(fā)生途徑和間接發(fā)生途徑可因條件不同而相互轉(zhuǎn)化的問題。 *按預(yù)決定觀點，從外植體組織或細胞直接形成體細胞胚的途徑，需要一種誘導(dǎo)物的合成或抑制物的消除，來恢復(fù)有絲分裂活動和促進胚胎發(fā)育。這時生長素對胚胎發(fā)生常起抑制作用，去掉生長素并給以必要的條件就使細胞進入分裂周期，并進行胚胎發(fā)生的表達。 *從外植體經(jīng)過脫分化形成愈

12、傷組織，間接產(chǎn)生體細胞胚的途徑，則需要分化細胞的重新預(yù)決定，稱為誘導(dǎo)的胚胎預(yù)決定的細胞（induced embroygenically determined cells,IEDC），這時則需要生長素，誘導(dǎo)細胞進入細胞周期。生長素不僅作為使細胞發(fā)生分裂所必需的物質(zhì)，而且也是使細胞進入胚胎狀態(tài)所必需的因素。 （4）按預(yù)決定觀點，生長素對由直接途徑和間接途徑體細胞胚發(fā)生的作用五、體細胞胚發(fā)育成植株的能力1 體細胞胚發(fā)育成植株的能力 *一般來說胚胎一旦被分化出來或甚至完成誘導(dǎo)之后轉(zhuǎn)移到基本培養(yǎng)基上即可發(fā)育成熟，并可形成小植株。 *如陳東方等（1986）對棒頭草幼穗培養(yǎng)的研究表明，體細胞胚形成之后，可以

13、在原來培養(yǎng)基上或MS無任何附加成分的培養(yǎng)基上以及1/2MS加IAA或NAA 0.5mg/L和6-BA 0.5mg/L培養(yǎng)基上萌發(fā)形成小植株。 1 莖尖培養(yǎng)誘導(dǎo)形成胚性愈傷組織 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D2 胚性愈傷組織懸浮培養(yǎng)增殖 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D3 由細胞集合體形成體細胞胚 MS培養(yǎng)基附加2.0mg/L 2,4-D 4 體細胞胚萌發(fā)并形成小植株 MS培養(yǎng)基附加1.0mg/L ABA 圖 甘薯品種栗子香胚性愈傷組織誘導(dǎo)體細胞胚和再生小植株 2 體細胞胚萌發(fā)的兩種不正?，F(xiàn)象 體細胞胚萌發(fā)時觀察到兩種不正常萌發(fā)現(xiàn)象： *一種是不完全萌發(fā)，即只有芽而無根或只有根

14、而無芽. *另一種是早熟萌發(fā)，即體胚還未表現(xiàn)出完整的胚結(jié)構(gòu)之前就已萌發(fā)，萌發(fā)時盾片膨大形成一葉狀體，在葉狀體基部長出芽。注意：體細胞胚胎途徑的形態(tài)發(fā)生能力要比器官分化途徑保持更長久。 六、影響體細胞胚發(fā)生的因素 （a）不同基因型體細胞胚誘導(dǎo)率； （b）不同基因型每個胚性外植體上體細胞胚的數(shù)目 圖6.7 在相同培養(yǎng)基上Feijoa sellowiana Berg不同基因型體細胞胚誘導(dǎo) （引自Miguel等，2001）n*離體植物細胞在開始往往缺乏合成生長素和細胞分裂素的能力，但是在大多數(shù)情況下，這些細胞的分裂和分化以及形態(tài)建成過程中又必需生長素和細胞分裂素兩種激素的共同作用。 n*在培養(yǎng)介質(zhì)中添

15、加不同種類或不同濃度的外源激素誘導(dǎo)形態(tài)發(fā)生已受到廣泛的重視。 n*但最關(guān)鍵的是組織內(nèi)部和體細胞胚發(fā)生部位的內(nèi)源激素代謝動態(tài)和平衡。n早在胡蘿卜細胞懸浮培養(yǎng)體細胞胚發(fā)生中發(fā)現(xiàn)，2，4-D在誘導(dǎo)胚性細胞早期是必需的，而且2，4-D是通過影響IAA結(jié)合蛋白起作用，其實質(zhì)是促進IAA結(jié)合蛋白的形成，提高細胞對IAA的敏感性從而誘導(dǎo)胚性細胞的形成。n水稻細胞培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，由于2,4-D促進細胞內(nèi)源IAA含量提高進而誘導(dǎo)胚性細胞的形成，并認(rèn)為內(nèi)源IAA含量上升或維持在較高水平，是胚性細胞出現(xiàn)的一個共同標(biāo)志。 n一些研究表明，ABA對植物體細胞胚的發(fā)生與發(fā)育具有重要作用。 n外源ABA與內(nèi)源ABA對體細胞胚

16、發(fā)生起到相互調(diào)節(jié)和促進的作用，而且通過補充提高外源ABA，可以明顯提高體細胞胚發(fā)生的頻率與質(zhì)量。n荔枝體細胞胚胎發(fā)生早期的內(nèi)源激素ABA與IAA和ABA與CTK（細胞分裂素）的質(zhì)量比增大，將有利于荔枝體細胞球形胚的形成。n 2，4-D與體細胞胚發(fā)生 n2，4-D是誘導(dǎo)多種植物離體培養(yǎng)體細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榕咝约毎闹匾に亍?n單子葉植物和雙子葉植物誘導(dǎo)體細胞胚胎發(fā)生時，所要求的2,4-D的濃度不同，對單子葉植物而言，一般要求較高濃度的2,4-D，其濃度范圍為0.5-5mg/L，通常使用濃度為2mg/L； n而對雙子葉植物而言，一般要求較低濃度的2,4-D，其濃度范圍為0.02-1mg/L，通常使用的濃

17、度為0.1mg/L。n在體細胞胚胎發(fā)生的誘導(dǎo)階段，培養(yǎng)基中必需添加2,4-D，而在體細胞胚胎形成階段，要降低培養(yǎng)基中2,4-D的濃度或去除2,4-D，以保證體細胞胚的正常生長。 n在胡蘿卜細胞培養(yǎng)中，加入2，4-D后誘導(dǎo)一些特異性多肽或蛋白質(zhì)形成，當(dāng)去除生長素后，這些多肽和蛋白質(zhì)也隨之消失。但在誘導(dǎo)出胚性細胞后，及時除去培養(yǎng)基中的2，4-D，胚性細胞在進一步分化和發(fā)育的同時釋放糖蛋白GP65（65kDa）表 在MS固體培養(yǎng)基上不同濃度2,4-D對木豆幼苗葉片外植體誘導(dǎo)和原胚細胞形成的影響2,4-D(M) Callus induction(%) Proembryonic cell*(%) 0.0

18、0 0.0 0.0 2.26 3.2d 3.4d 4.52 7.4c 10.2c 6.78 38.6a 37.4a 9.04 18.2b 12.8b 11.30 3.6c 2.2c 表 在具有不同濃度2,4-D的MS液體培養(yǎng)基上木豆不同時期體細胞胚誘導(dǎo)率2,4-D(M) 收集細胞的體積 (10th day) 體細胞胚發(fā)育時期 球形胚(%) 心形胚(%) 魚雷胚(%) 0.00 0 0 0 0 1.12 2.8e 2.4e 1.8e 1.2e 2.26 3.2d 7.6d 2.4d 1.6d 3.38 4.6c 20.2b 8.2b 5.2b 4.52 5.2b 36.2a 20.4a 16.4

19、a 5.64 5.6b 18.6c 6.6c 3.6c 6.78 6.2a 7.4d 1.6e 1.2e Origin of embryoids in embryo-derived callus culture. (a) Single cells (arrow) and two-celled stage (double arrows). x137. (b)Four-celled stage (arrowhead). x137. (c) Multicelled proembryo containing eight to ten cells. x137 (d) Epidermized lobula

20、r stage. x34. (e) Heart shape embryoid that remain in the callus. X34. (f) Several compact embryoids in different stages of formation. x14.A,C,E為離體培養(yǎng)6周后的體細胞胚；B,D,F為離體培養(yǎng)5個月后形成的體細胞胚 A:品種GK7 ，在添加83.0 mM centrophenoxine培養(yǎng)基上; B: 品種AT120，在添加124.4 mM centrophenoxine培養(yǎng)基上; C: 品種59-4144，在添加12.4 mM dicamba培養(yǎng)基上

21、; D:品種AT120，在添加83.0 mM dicamba培養(yǎng)基上; E: 品種VC1，在添加83.0 mM picloram培養(yǎng)基上; and F:品種VC1，在添加124.4 mM picloram培養(yǎng)基上. 圖 含不同種類和不同濃度生長素固體培養(yǎng)基上成熟花生胚軸體細胞胚誘導(dǎo) n 其它生長激素與體細胞胚發(fā)生 n除2,4-D外，ABA對植物體細胞胚的發(fā)生也起到重要的調(diào)控作用。 n研究表明，ABA具有促進藶蒿體細胞胚結(jié)構(gòu)正?；娘@著效應(yīng)。 n在濃度適宜時，ABA能抑制多種異常體細胞胚的發(fā)生，而且ABA加入培養(yǎng)基的時間愈早其效應(yīng)也越明顯。 n較低濃度的ABA對保持秈稻愈傷組織的胚性結(jié)構(gòu)具有重要

22、意義，可明顯提高這種胚性愈傷組織分化出苗率。 n在拐芹中ABA與NAA共同作用可誘導(dǎo)一些游離氨基酸含量的變化和特異蛋白的形成。 nABA和PEG對胡蘿卜(Daucus carota L.)體細胞胚發(fā)生具有調(diào)控作用3 多胺（腐胺、尸胺、亞精胺、高亞精胺、精胺等）和乙烯與體細胞胚發(fā)生 *外源多胺對體胚發(fā)生的作用除了取決于植物種類及其內(nèi)源多胺的狀況之外，還關(guān)系到它們?nèi)绾伪晃?、運輸及降解等問題。多胺與體細胞胚發(fā)生的關(guān)系在胡蘿卜的研究中較多。舉例說明： *已發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的胚性細胞中腐胺、精胺含量比非胚性的高，在胡蘿卜體細胞胚發(fā)生的前胚時期多胺含量一般較低，從球形胚、心形胚到魚雷胚時期，精胺和亞精胺逐漸升

23、高，心形胚時期以腐胺為主，魚雷胚時期則富含亞精胺。 *在胡蘿卜愈傷組織的體細胞胚發(fā)生中發(fā)現(xiàn)乙烯抑制體細胞胚的發(fā)生，而乙烯形成酶抑制劑Ni2+、Co2+可以促進其體細胞胚發(fā)生。 *有研究表明，只在胚細胞分化早期才與多胺生物合成關(guān)系較密切。4 糖類和金屬離子與體細胞胚發(fā)生 糖類 *糖類對誘導(dǎo)植物體細胞胚發(fā)生也是不可缺少的重要成分。 *研究表明，小麥的愈傷組織一旦分化為胚性細胞后就有淀粉粒的積累，在胚性細胞分化與發(fā)育的整個過程中，淀粉的兩次合成高峰均在發(fā)育的重要轉(zhuǎn)折期，為體細胞胚的進一步發(fā)育和分化提供必要物質(zhì)和能量基礎(chǔ)。淀粉的積累與胚性細胞分化能力和體細胞胚發(fā)育時期的轉(zhuǎn)折密切有關(guān)。 *在茴香的胚性細

24、胞中也富含淀粉粒，在體細胞胚發(fā)育中同樣出現(xiàn)兩次峰值，同時認(rèn)為淀粉出現(xiàn)的峰值與核酸和蛋白質(zhì)合成密切相關(guān)，因此，表明淀粉為蛋白質(zhì)和核酸的合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 碳水化合物 濃度（mM） 胚胎發(fā)育時期 球形胚（） 心形胚（） 魚雷胚（） 葡萄糖 Glucose 55.49 2.4f 1.2h 1.2g 110.99 6.8f 2.6h 2.4f 166.48 10.2e 5.0f 4.2e 221.98 13.6c 7.2d 6.4d 果糖 Fructose 55.49 6.2f 2.8g 2.4f 110.99 12.4c 5.2f 4.6c 166.48 6.4f 5.0f 4.2e 221.98

25、 2.4h 1.2h 1.2g 蔗糖 Sucrose 29.21 12.4c 6.8c 6.2d 58.43 20.2b 16.2b 14.6b 87.64 36.2a 20.4a 16.4a 116.86 12.6d 10.2c 8.4c 麥芽糖 Maltose 27.75 2.4h 1.2h n.d 55.51 5.4g 2.6g 1.2g 83.26 1.2i n.d n.d 111.02 n.d n.d n.d 表 在4.52M/L 2,4-D培養(yǎng)基上不同碳水化合物 對木豆愈傷組織懸浮培養(yǎng)體細胞胚發(fā)生的影響 金屬離子 *金屬離子對體細胞胚的發(fā)生也有影響。 *在小麥愈傷組織誘導(dǎo)體細胞胚發(fā)

26、生中也發(fā)現(xiàn)Zn2+、Cu2+、Co2+、Mn2+等金屬離子具有重要的促進作用，不僅可提高誘導(dǎo)頻率，而且還可以加速胚性愈傷組織的形成，因此，在培養(yǎng)基中加入適合濃度金屬離子可提高體細胞胚發(fā)生的頻率。 *有研究表明，金屬離子可能是通過促進多胺合成而提高體細胞胚發(fā)生頻率。 5 外植體與體細胞胚發(fā)生 不同基因型、外植體體細胞胚發(fā)生能力不同。如胡蘿卜子葉不同部位培養(yǎng)誘導(dǎo)的發(fā)育過程不同。只有表皮下細胞具有真正細胞全能性和有能力直接產(chǎn)生體細胞胚（胚胎發(fā)生區(qū)），而不用通過愈傷組織階段的誘導(dǎo)。 表皮下細胞 根發(fā)生區(qū)細胞 芽發(fā)生區(qū)細胞 胡蘿卜子葉不同部位外植體示意圖6 光與體細胞胚發(fā)生品種JackJack（光照強度

27、50-60 E m2 s-1） 品種 FayetteFayette（光照強度50-60 E m2 s-1） 品種JackJack（光照強度5-10 E m2 s-1） 品種FayetteFayette（光照強度5-10 E m2 s-1） (圖 光對大豆不同品種子葉體細胞胚發(fā)生的影響 )第二節(jié)第二節(jié) 人工種子人工種子一、人工種子的概念人工種子：又稱合成種子或體細胞種子，是指將植物離體培養(yǎng)的胚狀體或芽包裹在含有養(yǎng)分和保護功能的人工胚乳和人工種皮中的類似種子的顆粒。*人工種子可在一定條件下萌發(fā)生長，形成完整的植株。人工種子 依靠植物細胞“全能性”，美國首先發(fā)明“人工種子” 人工種子www.agr.

28、hokudai.ac.jp 不定胚形成人工種子www.brs.nihon-u.ac.jp 人工種子大量生產(chǎn) kankyo08.en.a.u-tokyo.ac.jp 人工種子結(jié)構(gòu)示意圖二、人工種子研究歷史 *1978年Murashige提出人工種子概念 *1986年Redenbaugh等成功地利用藻酸鈉包埋單個體細胞胚，生產(chǎn)人工種子。 *胡蘿卜、棉花、玉米、甘藍、萵苣、苜蓿等人工種子制作獲得成功。 *在我國人工種子的研究已列入重點攻關(guān)項目，并已取得一些重要的研究成果。 n三、人工種子各部分功能 n 1 體細胞胚 n為了使人工種子在一定條件下萌發(fā)生長，并形成完整植株，人工種子首先應(yīng)該具備一個能夠很

29、好地發(fā)育成完整植株能力的胚，它具有胚根和胚芽的雙極性，經(jīng)原胚、球形胚、心形胚、魚雷胚和子葉形胚等不同階段發(fā)育而成。 n 2、人工胚乳 n人工胚乳為體細胞胚萌發(fā)提供營養(yǎng)物質(zhì)。根據(jù)使用者的目的，可向人工胚乳內(nèi)自由添加有利于胚狀體正常萌發(fā)所需的各種營養(yǎng)成分、防病蟲物質(zhì)、植物激素等，也是人工種子優(yōu)越于天然種子之處。n四、人工種子種類 n 根據(jù)包裹體細胞胚材料的不同，可以將人工種子分為以下4種類型（Redenbaush等，1991）。 n（1）裸露的或休眠的繁殖體，可以直接播種，如休眠的微鱗莖和微型薯等。 n（2）人工種皮包裹的繁殖體。 n（3）水凝膠包埋的胚狀體、不定芽以及休眠的小鱗莖等繁殖體，水凝膠

30、中可含多種養(yǎng)分和激素，促進繁殖體的生長。 n（4）液膠包埋的繁殖體。 五、人工種子與天然種子比較有其自身的特點： （1）可對一些自然條件下不結(jié)實的或種子很昂貴的植物進行繁殖。 （2）固定雜種優(yōu)勢，使Fl雜交種可多代利用，使優(yōu)良的單株能快速繁殖成無性系品種，從而大大縮短育種年限。 （3）節(jié)約糧食。 （4）在人工種子的包裹材料里加入各種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、菌 肥、農(nóng)藥等，可人為地影響控制作物生長發(fā)育和抗性。 ( 5 )可以保存及快速繁殖脫病毒苗，克服某些植物由于長期營養(yǎng)繁殖所積累的病毒病等。 ( 6 )與試管苗相比成本低，運輸方便(體積小)，可直接播種和機械化操作。 六、目前人工種子涉及的問題 1、高質(zhì)

31、量和數(shù)量體細胞胚的誘導(dǎo)。 2、體細胞胚發(fā)生的同步控制。 3、人工種皮的制造與生產(chǎn)。 4、人工胚乳的研制。 5、工藝流程。 6、貯藏。 *獲得體細胞胚是生產(chǎn)人工種子的基礎(chǔ)，其發(fā)生頻率的高低、胚的質(zhì)量和體細胞胚發(fā)生的同步控制是生產(chǎn)人工種子的關(guān)鍵。*人工種子制備包括胚狀體的誘導(dǎo)與同步化、人工種子的包埋、人工胚乳的制作、人工種皮的制作、人工種子貯藏等步驟內(nèi)容。 1、高質(zhì)量和高產(chǎn)量的體細胞胚誘導(dǎo)與同步化控制 體細胞胚的誘導(dǎo)與同步化控制方法： 七 人工種子的研制體細胞胚誘導(dǎo)與同步化控制體細胞胚誘導(dǎo)與同步化控制 a 成熟的體細胞胚；b 用無菌吸管吸取與包埋劑混合的體細胞胚 c 帶體細胞胚的液滴滴入2CaCl

32、2溶液后形成的白色半透明的包埋丸； d 人工種皮包埋制成的人工種子 人工種子的制人工種子的制備備苜蓿體細胞胚的生產(chǎn)與植株的獲得苜蓿體細胞胚的生產(chǎn)與植株的獲得www.plant.uoguelph.ca/research/embryo/embryo.htm 2、人工種子包埋 獲得發(fā)育正常、形態(tài)上較為一致的體細胞胚后，就要用適合的材料進行包埋。進行包埋時應(yīng)做到以下幾點： （1）包埋材料必須對體細胞胚無損害和無毒性，并能保護胚和胚發(fā)芽的能力； （2）同時在制造、貯藏、運輸和種植過程中必須具有耐久性； （3）膠囊必須含有養(yǎng)分和植物激素以及植物生長和發(fā)育所需的成分和水分，并要求制作的人工種子適合于農(nóng)業(yè)機械

33、化播種。 3 包埋方法： 經(jīng)研究認(rèn)為藻酸鹽所形成的膠囊是目前最好的凝膠包埋材料，所采用的主要方法是滴注和裝膜兩種。 （1）滴注法 制備人工種子是將選擇好的體細胞胚懸浮于含2%3%的藻酸鈉溶液中，然后用一個塑料吸管吸注含體細胞胚的藻酸鈉懸滴加入到0.1mol/LCaCl2溶液中，這時離子間發(fā)生交換而形成膠囊，膠囊的直徑依賴于吸管的內(nèi)徑和吸注的速度，膠囊的大小，視體細胞胚的大小和發(fā)芽能力而定，一般采用吸管口徑為34mm，可得直徑為45mm的膠囊。體細胞胚包在膠囊中的位置不宜處在中央，宜偏在一邊以利萌發(fā)。至于聚合時間長短則依賴于所用試劑濃度。一般藻酸鈉的濃度控制在23%，在CaCl2中停留實踐不要超

34、過10min，以免膠囊太硬而影響發(fā)芽。形成膠囊后轉(zhuǎn)入無菌水中沖洗，最后在1/2MS培養(yǎng)基上作發(fā)芽和轉(zhuǎn)換試驗或進一步包裹人工種皮。 滴注法人工種子包埋過程示意圖（2）裝膜法 制備人工種子是把體細胞胚混合到一個溫度較高的膠液中，然后滴注到一個有小坑的微滴板上，隨著溫度降低變?yōu)槟z而形成膠丸。 4、人工種皮的研制 美國杜邦公司生產(chǎn)的Elvax4260是一種較好的“人工種皮”材料，是由乙烯、乙酸和丙烯酸三種物質(zhì)共聚的產(chǎn)物，用它作為人工種子最外層的包裹劑，即人工種皮取得較好效果 。 2、用Elvax作為人工種皮的具體操作程序為： （1）、將4g藻酸鈣膠囊置于20mL含0.1g葡萄糖和含0.2mL甘油的氫

35、氧化鈉溶液中攪拌1min； （2）、在50mL環(huán)乙烷中加入10%的Elvax4260; （3）、在40條件下溶解5g硬脂酸，10g鯨醋醇和25g鯨醋取代物，另加295mL石油醚和155mL二氯甲烷； (4)、 將藻酸鈣膠囊放在上述的混合液中浸泡10s，取出后用熱風(fēng)吹干。如此重復(fù)45次，最后用石油醚沖洗干凈，經(jīng)尼龍布過慮后在空氣中風(fēng)干即可。體細胞胚與人工種子 1、人工種子轉(zhuǎn)換定義 *轉(zhuǎn)換（Transformation）指人工種子在一定條件下，萌發(fā)、生長、形成完整植株的過程。 2、轉(zhuǎn)換方法 *轉(zhuǎn)換的方法可分為無菌條件下的轉(zhuǎn)換和土壤條件下的轉(zhuǎn)換。 八、人工種子的轉(zhuǎn)換試驗（1）、無菌條件的轉(zhuǎn)換：其也稱

36、離體條件的轉(zhuǎn)換。一般是將新制成的人工種子播種在1/4MS培養(yǎng)基，附加1.5%麥芽糖、8g/L的瓊脂中，培養(yǎng)后統(tǒng)計人工種子形成完整植株的數(shù)目，即人工種子的轉(zhuǎn)化率。 （2）、無菌條件轉(zhuǎn)換率的高低主要取決于： （a）、對提高體細胞胚質(zhì)量的培養(yǎng)基成分的研究； （b）、改進轉(zhuǎn)換條件的研究。如麥芽糖代替蔗糖，有利于體細胞胚的萌發(fā)和轉(zhuǎn)換。 n體細胞胚發(fā)育成植株，大致經(jīng)歷幾個階段： n發(fā)芽 根系的發(fā)育 芽分生組織的生長和發(fā)育 真葉的生長 芽和根的連接 正常植株生長蘭花人工種子的生產(chǎn)及其獲得的小植株（3）、土壤條件的轉(zhuǎn)換：也稱活體條件下的轉(zhuǎn)換。人工種子真正目的是直接播種于土壤，即在活體條件下，使轉(zhuǎn)換成功。 （4

37、）土壤條件下轉(zhuǎn)換采用方法： a、無土培養(yǎng)試驗：目前以蛭石或珍珠巖試驗較多，附加低濃度無機鹽，1/6的MS培養(yǎng)基，0.75%麥芽糖有利于轉(zhuǎn)換。 b、土壤試驗：人工種子的土壤轉(zhuǎn)化試驗報道較少。苜蓿人工種子的直接土壤轉(zhuǎn)化試驗已達20%，水稻不定芽研制的人工種子經(jīng)適當(dāng)?shù)剡^渡性培養(yǎng)，在土壤中的轉(zhuǎn)化率為10%。 （5）、土壤條件的轉(zhuǎn)換人工種子轉(zhuǎn)化率低的主要限制因子 a、研究無機鹽在轉(zhuǎn)換中的重要性時表明，沒有硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈣時就不會發(fā)生轉(zhuǎn)換，缺乏磷酸銨，轉(zhuǎn)化率從30%降至5%。顯然這些無機鹽成分作為人工種子營養(yǎng)肥料是不可缺少的。 b、0.75（W/V）的麥芽糖有利于提高轉(zhuǎn)化率。因此推測，碳源在人工種子

38、轉(zhuǎn)換中也是限制因子。 因此，必須在人工種子中貯藏必需的養(yǎng)分或供給外源營養(yǎng)物質(zhì)。 n九、人工種子的儲藏與萌發(fā) n人工種子儲藏時間的長短和萌發(fā)率的高低對人工種子的應(yīng)用至關(guān)重要。人工種子的壽命，其最理想的狀態(tài)是能夠與真正的合子胚種子的壽命一樣長，只有這樣，才有利于人工種子的儲藏和萌發(fā)。 n此外，海藻酸鹽膠囊本身又抑制呼吸，更加縮短了體細胞胚的壽命。因此，儲藏和萌發(fā)是人工種子研制的主要難點之一。 n延長人工種子儲藏時間和提高其萌發(fā)率的主要方法包括低溫法、干燥法、抑制法、液體石蠟法等以及這些方法的組合。 n干燥法和低溫法是目前應(yīng)用最多的方法。（1）低溫儲藏技術(shù) n低溫儲藏是指在不傷害植物繁殖體的前提下,

39、通過降低溫度來降低繁殖體的呼吸作用,使之進入休眠狀態(tài)。 n 常用的溫度一般是4。在此溫度下體細胞胚人工種子可以儲存1-2 個月。n如茶枝柑( C itrusreticu la ta 的人工種子,儲存1個月仍具很高轉(zhuǎn)化率。泡桐( Pau low n ia elonga ta 的人工種子在儲藏30 d或60 d后體細胞胚的存活率分別是67. 8%和53. 5% ,萌發(fā)率分別是43. 2%和32. 4%。n非體細胞胚人工種子可以在4下儲藏更長的時間,Mandal等( 2000對4 種羅勒屬( Ocim um )的植物腋芽進行包被,可保存60 d,并使植物耐寒性提高。 nDatta 等( 1999 包被瀕危植物地寶蘭( Geodorum densif lorum )類原球體,儲藏120 d后,生存能力與儲藏前相比無明顯變化。 n馬鈴薯芽尖在MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2 d后,用海藻酸鈉包被,儲藏270 d、360 d和390 d 后在MS培養(yǎng)基上的萌發(fā)率分別是100%、70. 8%和25%。n由于人工種子沒有像自然種子一樣在儲藏前進入休眠狀態(tài),隨著低溫儲存時間的加長,包被體系內(nèi)的含氧量降低,人工種子萌發(fā)率會下降n（2）液體石蠟儲藏技術(shù) n液體石蠟作為經(jīng)濟、無毒穩(wěn)定的液體物質(zhì),常被用來儲藏細菌、真菌和植物愈傷組織。美國已有報