qPCR實(shí)驗操作流程

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上Q-PCR實(shí)驗流程一、 實(shí)驗前準(zhǔn)備，每天早上到實(shí)驗室后，先把超凈工作臺的紫外燈打開15-20分鐘。超凈臺前做實(shí)驗，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需帶口罩。取EP管/槍頭時需用鑷子，不可以用使用過的手套直接取用。取完EP管/槍頭后，袋子及時封好。橡膠手套須放入超凈臺照射紫外，實(shí)驗操作過程中不得帶出超凈臺，移液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用75%乙醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺面。實(shí)驗進(jìn)行的過程中或觀看實(shí)驗時，沒有帶口罩不要在超凈臺前講話。二、 總RNA抽提1）細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸干凈，加入1ml Trizo

2、l （Invitrogen）溶液，吹打混勻，并吸至1.5ml RNase free EP管中使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5min；組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol （Invitrogen）溶液，混勻，室溫放置5min使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標(biāo)記樣品名稱）2） 加入200l氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置3-5min；（離心時離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順序也按順序排好，與第一步的順序一致）3） 4下，14,000g離心15min，可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一個新的RNase free EP管；（用20-200ul的槍吸取上清，吸上

3、清時，槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）4） 沉淀RNA：加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次）（不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置10min；5） 4下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀（如離心后仍不見EP管底部有沉淀，應(yīng)將EP管放置在-80度冰箱過夜，繼續(xù)在4下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀），去上清；6） 用75乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）（加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺風(fēng)干；沉淀不能過干或過濕，過干則不易溶解，過濕則乙醇?xì)埩簟?） 視沉淀量加入適量DEPC水（至少15ul）溶解沉

4、淀。三、去基因組 使用RNase-free的DNase （Promega），按以下體系配置反應(yīng)液，37消化30min，65滅活10min。RNA DNase 10 x buffer H2O(RNase free) RNasin 30201039.50.5µlµlµlµlµl總體積100µl 然后按以下步驟操作： 1) 加入等體積的苯酚/氯仿，上下顛倒混勻，室溫放置5min，后14,000rpm，離心15min，取上清。2) 加入等體積的氯仿，上下顛倒混勻，靜置分層后14,000rpm，離心15min，取上清。3） 加入等體積異丙醇，輕

5、柔地充分混勻（顛倒6-8次），-20靜置15min；4） 4下，14,000g離心15min，收集RNA沉淀，去上清；5） 用75乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min），超凈臺風(fēng)干；6） 加入適量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。四、總RNA純度和完整性檢測1） 純度檢測：取1l RNA樣品50倍稀釋，在核酸蛋白檢測儀上測定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，說明制備的RNA較純，無蛋白質(zhì)污染。2） 總RNA完整性檢測：取RNA樣品1l，1瓊脂糖凝膠電泳80V×20min，EB染色10min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，總RNA的5s rRNA， 18s rRNA和2

6、8s rRNA條帶，三條條帶完整的話即可證明總RNA抽提比較完整。五、逆轉(zhuǎn)錄1. mRNA：1) 在RNase free的PCR管中配置下列溶液.Total RNA H2O 1.0µgµl總體積12µl2) 將上述溶液吹打均勻，置85保溫5min，使RNA變性。隨后立即冰上致冷， 以防止RNA復(fù)性；3) 在該P(yáng)CR管中加入下列試劑（Promega）oligo（dT）Random primer 10mM dNTP RNase inhibitor 5 x buffer M-MLV 0.50.52.00.54.00.5µlµlµlµ

7、;lµlµl總體積8.0µl4) 將上述20l反應(yīng)溶液30保溫10min；5) 42保溫50min；6) 85保溫10min；7) -20保存。2. microRNA：使用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄法，原理如下圖：1） 在去RNase的PCR管中配置以下溶液.total RNAX個miR逆轉(zhuǎn)錄引物 H2O 1.00.5*X µgµl總體積12.5µl2）將上述溶液混勻，85孵育5min，以打開RNA二級結(jié)構(gòu)。隨后立即置于冰上，以防止RNA復(fù)性再次恢復(fù)二級結(jié)構(gòu)；3） 在另一去RNase的PCR管中配置以下溶液：10mM dNTP (promega) R

8、Nase inhibitor (promega) U6逆轉(zhuǎn)錄引物5x buffer M-MLV (promega) 2.00.50.54.00.5µlµlµlµlµl總體積7.5µl4） 將3）溶液加入到1）溶液中，混勻后30保溫10min； 5） 42孵育50min；6） 85孵育10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。四、定量PCR檢測1.引物測試：根據(jù)mRNA設(shè)計的引物正式實(shí)驗前需進(jìn)行qPCR測試其特異性和擴(kuò)增效率，具體反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如正式實(shí)驗，每對引物需做模板水對照。得到結(jié)果后，首先根據(jù)熔解曲線判斷引物特異性，選擇標(biāo)準(zhǔn)為：單峰且峰形偏窄、

9、水對照無明顯引物二聚體熔解曲線峰。若設(shè)計的多對引物熔解曲線均顯示特異性良好，則應(yīng)對比各引物的擴(kuò)增曲線，優(yōu)先選擇Ct值小、擴(kuò)增效率高的引物進(jìn)行正式實(shí)驗。2確定上機(jī)內(nèi)容后，首先在記錄本上編排好上機(jī)的樣品排放順序。（1）一個樣品的加樣盡可能安排在同一行（2）如正式實(shí)驗中三次重復(fù)不能安排在同一板上，則需把三次重復(fù)中的實(shí)驗分開，但同一次重復(fù)的實(shí)驗不能分開兩板3正式實(shí)驗：體系配制：H2O 4ulSYBR Green PCR Master Mix 10ul (TOYOBO)(使用前需振蕩均勻)上游引物 0.5ul （10uM）下游引物 0.5ul （10uM） 總體積 15ul計算好實(shí)驗中需用多少份體系，則

10、按具體量配置。體系分裝會有損失，一般多配0.5份-1份體系。總的體系配好后，在振蕩器中振蕩均勻或用槍吸打均勻，然后15ul每管分裝至8連管中。3cDNA用滅菌純水稀釋適當(dāng)?shù)臐舛?，一般?:20稀釋，如遇到基因表達(dá)低的樣品，則適當(dāng)降低稀釋比例至1:10或1:5。cDNA按一定順序排好后，即可加至剛配好的反應(yīng)體系中。加樣完畢，蓋好八連管蓋，并在八連管蓋最上沿的邊上標(biāo)記好1-12的順序（不可將標(biāo)記寫在反應(yīng)管的蓋子上，八連管蓋避免裸手觸摸中間透明的熒光采集區(qū)域，且保證每孔均蓋緊，否則影響重復(fù)性或可能出現(xiàn)熔解曲線峰漂移。）4把各排八連管放在掌上離心機(jī)上離心數(shù)秒。五上機(jī)：5.1 先開電腦，進(jìn)入Windows 界面。接著打開PCR儀電源開關(guān)。5.2 打開7500軟件，選擇“新建”，在“Template”下拉菜單中選擇“60”或“65”（普通基因檢測為“60”，MicroRNA檢測為“65”）5.3 打開樣品架，放入八連管，關(guān)上樣品架，并在軟件上選擇已放反應(yīng)管的孔位，剔除無反應(yīng)管的孔位。5.4 點(diǎn)擊File菜單中Save，輸入要保存結(jié)果的文件名，命名為日期-上機(jī)時間-客戶名字簡寫，如-1008-WL表示8月30日10點(diǎn)08分魏立的實(shí)驗。5.5 點(diǎn)擊Start鍵，開始運(yùn)行程序。5.6 程序運(yùn)行完畢后