改變組織醛固酮及其受體表達對SHR大鼠腎臟纖維化的影響

1、改變組織醛固酮及其受體表達對SHR大鼠腎臟纖維化的影響 作者：成彩聯(lián)， 婁探奇， 湯 穎， 石成鋼， 陳珠江 【摘要】 【目的】觀察改變腎組織醛固酮及其受體水平對自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化的影響?！痉椒ā?周齡的雄性自發(fā)性高血壓大鼠（SHR） 24只及同源正常京都大鼠（WKY） 8只，SHR分為貝那普利干預(yù)組30 mg/(kg·d)、大劑量安體舒通干預(yù)組100 mg/(kg·d)和高血壓模型對照組，同時設(shè)同源的正常對照組，干預(yù)時間為8周，檢測收縮壓、尿蛋白、血白蛋白、尿素氮、肌酐、腎組織醛固酮受體、TGF-1的mRNA和蛋白表達?！窘Y(jié)果】貝那普利能下調(diào)組織醛固酮（15.8&

2、#177;2.6）vs(22.2±0.6）pg/mg及其受體水平(15±4)vs(13±5)PU并減輕腎臟纖維化(17.0±1.8)vs(20.0±2.3)PU，均為P< 0.05；大劑量安體舒通能上調(diào)組織醛固酮（24.3±4.6）vs(22.2±0.6）pg/mg及其受體水平(16±6)vs(13±5) PU并加重腎臟纖維化(22.6±3.0)vs(20.0±2.3)PU，均為P< 0.05。【結(jié)論】腎組織醛固酮及其受體水平的改變可能影響高血壓腎臟纖維化的

3、過程。 【關(guān)鍵詞】 醛固酮； 醛固酮受體； 調(diào)節(jié)； 高血壓； 腎臟纖維化高血壓主要通過促進動脈硬化形成導(dǎo)致的腎組織缺血性病變及通過腎小球高壓力、高灌注、高濾過導(dǎo)致腎臟病變。醛固酮作為腎臟纖維化進程中的一個重要因素，已成為腎臟纖維化研究中的熱點之一。醛固酮受體在器官纖維化中的作用也開始受到重視1，并有學(xué)者嘗試改變靶器官中醛固酮受體的表達來影響器官纖維化的進程2。但醛固酮受體在器官纖維化中作用的研究多集中在心臟方面，在腎臟領(lǐng)域研究很少。本研究旨在研究改變?nèi)┕掏荏w表達對腎臟纖維化的影響。 1 材料與方法 1.1 實驗對象及分組 24只8周齡的雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hyp

4、ertensive rats, SHR），質(zhì)量200250 g，購自上海市高血壓研究所。SHR分為大劑量安體舒通干預(yù)組100 mg/（kg·d）；貝那普利干預(yù)組30 mg/（kg·d）（將藥物溶于4 ml飲用水中灌胃）；高血壓模型組；同時設(shè)同源的正常對照組京都大鼠（WKY）8只，高血壓對照組及正常對照組予4 mL飲用水灌胃，干預(yù)時間為8周。 1.2 觀察指標及檢測方法 1.2.1 收縮壓 大鼠的收縮壓采用RBP-1B型大鼠血壓計進行測量。 1.2.2 尿蛋白和血生化（白蛋白、尿素氮、肌酐） 采用OLYPUS AU640全自動生化分析儀檢測。 1.2.3 血漿和組織醛固酮含量

5、測定 取血2 mL，加入肝素20 ?滋L抗凝，3000 r/min離心10 min（r20 cm），取上清測血漿醛固酮含量（pg/mL）；取待測腎組織稱重后加入0.5 mol/L的乙酸，100 水浴15 min，冷卻后勻漿，12000 r/min離心15 min，取上清液檢測組織醛固酮含量（pg/mg）。測試盒由北京北方免疫試劑研究所提供，按試劑說明書操作。 1.2.4 腎小管間質(zhì)損傷評分 切片進行HE染色，參照文獻3進行評分，200倍光鏡下，每張切片隨機選擇10個不含腎小球的視野。腎小管間質(zhì)病變由3個參數(shù)判定（小管擴張和蛋白管型；炎癥細胞浸潤；間質(zhì)纖維化）每個參數(shù)按03分評定（0正常，1輕度

6、受損，2中度受損，3重度受損）。每個樣本小管間質(zhì)的評分為09分。 1.2.5 腎小球內(nèi)膠原沉積 切片進行MASSON染色，參照文獻4進行評分，200倍光鏡下，每張切片隨機選擇腎組織內(nèi)5個腎小球，利用圖像分析系統(tǒng)，首先檢測腎小球總面積，再檢測相應(yīng)腎小球內(nèi)膠原的總OD(光密度)值（藍色代表膠原纖維），計算膠原纖維OD/腎小球總面積，代表膠原纖維的含量。 1.2.6 腎組織轉(zhuǎn)化生長因子和醛固酮受體mRNA 采用RT-PCR方法，TRIZOL試劑購于Invitrogen Life Technologies公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自晶美生物公司，PCR反應(yīng)預(yù)混液購自寶生物工程（大連）有限公司。取總量為4 ?

7、滋g的總RNA，以Random Primer為引物合成cDNA第一鏈，以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。PCR擴增條件：GAPDH（725 bp）：94 2 min，94 30 s，52 30 s，72 45 s，72 10 min，32個循環(huán)；TGF-1（432 bp）：94 2 min，94 30 s，52 30 s，72 45 s，72 10 min，32個循環(huán)；MR（486 bp）：94 2 min，94 1 min，49 1 min，72 1 min，72 10 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)溴化乙錠染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，全自動凝膠成像和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)掃描照相，分析電泳帶的

8、灰度，以與內(nèi)參照GAPDH的條帶密度A值之比半定量表達水平。 1.2.7 腎組織TGF1和醛固酮受體蛋白 采用免疫組化方法，兔抗大鼠TGF-1單克隆抗體（使用濃度為1 100）購自Santa Cruz公司，抗兔SABC免疫組化試劑盒購自北京中山生物有限公司，山羊抗大鼠醛固酮受體多克隆抗體（使用濃度為1 50）及抗山羊SABC免疫組化試劑盒均購自Santa Cruz公司。用德國 KONTRON IBAS 2.5全自動圖象分析系統(tǒng)進行免疫組化結(jié)果定量分析5。 1.3 統(tǒng)計方法 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，統(tǒng)計軟件采用SPSS11.0，根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩

9、比較用LSD-t檢驗，方差不齊資料采用Games-Howell法進行兩兩比較，等級資料采用秩變換分析方法進行比較，=0.05。 2 結(jié) 果 2.1 血漿及組織醛固酮水平、醛固酮受體mRNA和蛋白的表達情況 高血壓對照組大鼠腎臟的醛固酮及其受體均高于正常對照組（P< 0.05），貝那普利干預(yù)后，腎臟的醛固酮及其受體較高血壓對照組明顯降低(P< 0.05)；而大劑量安體舒通干預(yù)后，腎臟的醛固酮及其受體較高血壓對照組明顯升高(P< 0.05)，見圖1、圖2和表1。 2.3 臨床指標 高血壓對照組大鼠自實驗開始時（8周齡）已出現(xiàn)高血壓，此后，隨著周齡增大，血壓

10、逐漸升高，在觀察時間為8周（16周齡）時血壓已升至180 mmHg左右，出現(xiàn)明顯的蛋白尿和低白蛋白血癥(P< 0.05)，血尿素氮和肌酐水平與正常對照組無明顯區(qū)別(P >0.05)，正常對照組大鼠整個觀察時間內(nèi)都沒有出現(xiàn)高血壓。貝那普利干預(yù)后，血壓逐漸下降，尿蛋白明顯降低（P< 0.05），血白蛋白水平升高（P< 0.05）；大劑量安體舒通干預(yù)后，血壓沒有明顯改變(P >0.05)，尿蛋白升高（P< 0.05），血白蛋白減少（P< 0.05）；血尿素氮和肌酐水平在各組間無明顯區(qū)別（P &g

11、t;0.05），見表2。 2.4 病理指標 與正常對照組相比，高血壓對照組可以看到蛋白管型，小管擴張，管周炎癥細胞浸潤，腎小球內(nèi)膠原形成增多（P< 0.05）；貝那普利干預(yù)后，腎小球內(nèi)膠原形成明顯減少（P< 0.05）；安體舒通干預(yù)后，膠原形成明顯增多（P< 0.05），見圖3和表3。 2.5 腎組織TGF-1mRNA和蛋白的表達 高血壓對照組腎組織TGF-1mRNA和蛋白的表達比正常對照組高（P< 0.05），貝那普利干預(yù)后，腎組織TGF-1mRNA和蛋白的表達較高血壓對照組明顯降低（P< 0.05）；大劑量安體舒通干預(yù)后

12、，腎組織TGF-1mRNA和蛋白的表達明顯升高，與高血壓對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P< 0.05），見圖4、圖5和表3。 3 討 論 腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)對體內(nèi)體液平衡和血壓調(diào)節(jié)起著主要作用，醛固酮是有絲分裂和膠原合成的強烈刺激劑，可以促進心肌和腎臟纖維化6。醛固酮受體作為其中的一個重要環(huán)節(jié)，可能在腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展中起一定的作用。 本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR組大鼠血壓升高，尿蛋白明顯增多，白蛋白明顯下降，腎小球內(nèi)膠原沉積增多，血管周圍炎癥細胞浸潤、小管擴張、蛋白管型、腎臟損傷明顯，腎臟的TGF1mRNA和蛋白表達也比正常對照組高，提示高血壓可導(dǎo)致腎損傷和腎臟纖維化。本實驗同時觀

13、察到SHR組大鼠血漿和組織的醛固酮水平及腎組織的醛固酮受體mRNA和蛋白表達均明顯高于正常對照組。Delano等7亦觀察到自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜毛細血管上醛固酮受體的密度高于正常對照組，導(dǎo)致對醛固酮的反應(yīng)升高的報道相符。由此我們設(shè)想，腎組織醛固酮及其受體的水平升高可能參與了腎損害的過程，改變腎臟醛固酮及其受體水平可能對腎臟纖維化有所影響。本實驗發(fā)現(xiàn)予貝那普利下調(diào)腎臟的醛固酮及其受體表達后，蛋白尿明顯減少，血白蛋白明顯增高；腎小球內(nèi)的膠原形成明顯減少，腎小管的擴張減輕，小管上皮細胞基本恢復(fù)正常，基本看不到蛋白管型，血管周圍炎癥細胞浸潤減輕，與Beggah等2用反義RNA鏈減少醛固酮受體表達后心臟

14、纖維化減輕的現(xiàn)象相似。同時予大劑量安體舒通上調(diào)腎臟醛固酮及其受體的水平后，尿蛋白明顯增加，血白蛋白水平下降，間質(zhì)炎癥細胞浸潤加重，血管壁增厚、玻璃樣變、血管腔縮小甚至閉塞、腎小管萎縮、蛋白管型、腎小球內(nèi)膠原形成增多等病變，有部分腎小球硬化，腎間質(zhì)的TGF1mRNA和蛋白表達增高，與Yoshida 1報道的舒張性心力衰竭心肌組織中醛固酮受體的表達增高促進心肌纖維化的發(fā)展有相似之處，盡管觀察的靶器官不同。以上結(jié)果提示，改變組織醛固酮及其受體水平可能影響腎臟纖維化的進程，但尚需進一步研究證實。 雖然有其他措施可以下調(diào)腎臟醛固酮受體的表達，如環(huán)孢霉素A（CsA）等，但這些措施在臨床實際應(yīng)用中并不可行，

15、或存在其它對機體不利的因素。目前國內(nèi)外尚未見到ACEI下調(diào)腎臟醛固酮受體的相關(guān)報道，De Resende等8研究發(fā)現(xiàn)卡托普利可以使梗死的心肌組織中升高的醛固酮受體表達恢復(fù)正常，但對腎組織正常表達的醛固酮受體沒有影響。我們觀察到的結(jié)果不同可能與所使用的動物模型不同有關(guān)。本研究的發(fā)現(xiàn)為ACEI治療腎臟纖維化提供了新的依據(jù)，同時也提示這可能是ACE治療腎臟纖維化的部分機制。 大劑量安體舒通上調(diào)腎臟醛固酮受體的表達后，腎組織中升高的醛固酮受體不但因結(jié)合了大量的安體舒通表現(xiàn)出激動效應(yīng)9，而且還有部分醛固酮受體可結(jié)合醛固酮，兩種效應(yīng)相加，加重了腎臟纖維化。目前關(guān)于大劑量安體舒通上調(diào)醛固酮受體僅在大腦有報道

16、10。國內(nèi)外雖然也有個別關(guān)于大劑量安體舒通導(dǎo)致腎臟纖維化加重的報道12，但未見上調(diào)腎臟醛固酮受體的報道。本研究結(jié)果提示大劑量安體舒通可能加重腎臟纖維化，為臨床正確掌握使用安體舒通的劑量提供了一定的參考意見。 本研究結(jié)果提示，醛固酮及其受體的表達水平與高血壓致腎臟纖維化可能有關(guān)，改變其表達水平可能影響腎臟纖維化的進程?！緟⒖嘉墨I】 YOSHIDA M, MA J, TOMITA T, et al. Mineralocorticoid receptor is overexpressed in cardiomyocytes of patients with congestive heart fail

17、ureJ.Congest Heart Fail, 2005, 11(1):12-16.BEGGAH A T, ESCOUBET B, PUTTINI S, et al. Reversible cardiac fibrosis and heart failure induced by conditional expression of an antisense mRNA of the mineralocorticoid receptor in cardiomyocytesJ. Proc Natl Acad Sci, 2002, 99(10):7160-7165.TAAL MW,ZANDI-NEJ

18、AD K,WEENING B, et al. Proinflammatory gene expression and macrophage recruitment in the rat remant kidney J. Kidney Int,2000,58(4):1664-1676.MORIYAMA T, KAWADA N, NAGATOYA K, et al. Fluvastatin suppresses oxidative stress and fibrosis in the interstitium of mouse kidneys with unilateral ureteral ob

19、structionJ. Kidney Int,2001,59(6):2095-2103.申 洪 .免疫組織化學(xué)染色定量方法研究 J. 中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志,1995, 4(1):89-91.高修仁，彭龍云，曾群英，等.充血性心衰ACEI治療中醛固酮逃逸現(xiàn)象與心率變異的研究 J. 中山大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2003，24（3）：277280.DELANO F A, SCHMID-SCHONBEIN G W. Enhancement of glucocorticoid and mineralocorticoid receptor density in the microcirculation of the spontaneously hypertensive ratJ. Microcirculation, 2004, 11(1): 69-78.DE RESENDE M M, KAUSER K, MILL J G. Regulation of cardiac and renal mineralocorticoid receptor e