_聚賴氨酸測定方法的改進(jìn)

1、 第 22卷 第 2期 2007年 6月V ol.22 No. 2 Jun. 2007 收稿日期:2006-10-30; 修回日期:2007-01-17基金項(xiàng)目:國家“十五”科技攻關(guān)項(xiàng)目(2004BA713B05-061 ;天津科技大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20060207 作者簡介:曹偉鋒(1981 ,男,河南人,碩士研究生 .-聚賴氨酸測定方法的改進(jìn)曹偉鋒,譚之磊,袁國棟,賈士儒(天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457摘 要 :研究了甲基橙法測定-聚賴氨酸的試驗(yàn)條件 , 得出結(jié)論:甲基橙從水中重結(jié)晶后 , 溶于 pH6.6、 0.1 mol/L磷 酸鈉緩沖

2、液中 , 終濃度為 1 mmol/L; 將 2 mL-聚賴氨酸溶液與 2 mL 1 mmol/L甲基橙溶液混合; 混合物在 30條件 下劇烈振蕩 30 min , 4 000 r/min離心 15 min; 取 1 mL 上清液稀釋 50倍 , 在 465 nm 波長下測吸光度 , 計(jì)算-聚賴氨酸 含量.關(guān)鍵詞 :甲基橙; -聚賴氨酸;比色法中圖分類號 :O657.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 :A 文章編號 :1672-6510(2007 02-0009-03Improvement of the Assay Method for-polylysineCAO Wei-feng , TAN Zhi-lei ,

3、 YUAN Guo-dong , JIA Shi-ru(College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,Tianjin 300457, ChinaAbstract :The conditions of detecting -polylysine (-PL concentration by the methyl orange were studied in the paper. Theresults

4、 were as follow. After recrystallization from water,methyl orange was dissolved in 0.1mol/L sodium phosphate buffer (pH6.6 at a final concentration of 1 mmol/L. Then 2ml -PL solution was mixed with 2ml methyl orange solution. The mixtureswere vigorously reacted on a reciprocal shaker at 30 for 30min

5、 and then centrifuged for 15min at 4000 r/min. The absorbanceof the supernate diluted 50-fold was read at 465nm and the -PL content was calculated. Keywords :methyl orange; -polylysine;colorimetric method1972年 Itzhaki 1根據(jù)甲基橙與聚賴氨酸間形成復(fù)合物的特性 ,建立了用甲基橙測定聚賴氨酸含量的 方法 . 1973年 M.hatano 2 研究了聚-L -賴氨酸-甲基 橙反應(yīng)體系中

6、的旋光性 , 證實(shí)依靠甲基橙分子磺酸基 上陰離子與聚賴氨酸氨基陽離子間形成的離子對 , 在pH310范圍內(nèi)聚賴氨酸能和甲基橙形成復(fù)合物 ,且 形成的離子對發(fā)生在一個或兩個甲基橙分子與聚賴 氨酸一個氨基殘基上 . 1977年日本學(xué)者 S.shima 3和 H.sakai 從放線菌培養(yǎng)過濾液中提取出一種含有 2530個賴氨酸殘基的同型單體聚合物 , 這種賴氨酸聚合 物是賴氨酸殘基通過 -羧基和與另一賴氨酸殘基的 -氨基形成酰胺鍵連接而成 4 , 稱為 -聚賴氨酸(-PL , -PL 的測定按照 Itzhaki 在 1972年建立的 測定方法進(jìn)行 . 在國內(nèi) , 董惠鈞 5和姜俊云 6首先借鑒 It

7、zhaki 的方法 , 用甲基橙測定 -PL , 但由于發(fā)酵液成 分的復(fù)雜性 ,造成測定結(jié)果重現(xiàn)性差 . 因此 , 本文通過 研究測定條件及發(fā)酵液中存在因素對 -PL 測定的影 響 , 確定了甲基橙法測定 -PL 的條件 .1 材料與方法1.1 試劑及儀器甲基橙 ,天津市凱通化學(xué)試劑有限公司; 聚賴氨酸 標(biāo)準(zhǔn)品 , Sigma 公司 .752紫外光柵分光光度計(jì) , 上海精密科學(xué)儀器有限 公司 .1.2 方法 6將從水中重結(jié)晶甲基橙 (methyl orange,MO 配成 不同濃度 ,分別與不同濃度的 -PL 在 30 反應(yīng) , 劇烈 震蕩; 反應(yīng) 30 min, 4 000 r/min離心

8、15 min, 取上清液 1·10· 第 22卷 第 2期 mL稀釋至 50 mL, 在 465 nm1下測定稀釋液的 A 465; 反 應(yīng)體系含甲基橙溶液 2 mL, -PL 溶液 2 mL.2 結(jié) 果2.1 甲基橙濃度的影響將重結(jié)晶甲基橙配成不同濃度的水溶液 ,測定其 A 465,以蒸餾水為對照 , 結(jié)果如表 1. 當(dāng)甲基橙濃度為 0.08 mmol/L時(shí) , 達(dá)到最大量程 . 因此 , 用分光光度計(jì)測 定甲基橙的濃度應(yīng)小于 0.08 mmol/L.表 1 甲基橙濃度的影響Tab.1 Effect of methyl orange concentration甲基橙 /m

9、mol·L-1-取不同濃度甲基橙溶液, 分別加入同體積同濃度 的 -PL 溶液 , 反應(yīng)后的上清液用蒸餾水稀釋 , 至甲基 橙濃度為 0.1 mmol/L, 測定結(jié)果見圖1.圖 1 不同甲基橙濃度下的上清液 A 465的變化 Fig. 1 Variation of A 465 of supernatants withmethyl orange concentration不同濃度甲基橙與 -PL 反應(yīng)的程度存在差別 , 表 現(xiàn)為離心后形成的 -PL -甲基橙復(fù)合物量上的多寡 ,或上清液 A 465不同(圖 1a . 甲基橙濃度 0.11mmol/L(圖 1b , A 465變化與之成線

10、性 (R 2=0.99. -PL 的測定 是以甲基橙 A 465的減少值來換算的 . 當(dāng)用 1 mmol/L甲 基橙溶液反應(yīng)時(shí) A 465為 0.410, -PL 與甲基橙稍有反應(yīng) , 即可使其反應(yīng)后上清液的 A 465升高 , 處于線性區(qū) . 2.2 pH的影響已知甲基橙水溶液中的變色間隔為 pH3.14.4, pH 小于 3.1時(shí) , 甲基橙 呈 紅 色; pH 3.14.4, 則 呈 橙色; pH 大于 4.4時(shí) , 甲基橙 呈 黃 色 7, pH 對甲基橙水溶液的 影響 情況 見表 2. 當(dāng) pH 大于 4.4, pH 對甲基橙溶液 A 465值影響不大 . 采 用 pH 6.6、0.

11、1 mol/L磷 酸 鈉緩沖 液 (用 35.8 g/L Na2HPO 4·12H2O 溶液 調(diào)節(jié) 15.6 g/L NaH 2PO 4·2H2O 溶液 pH 至 6.6來 維持 pH 的 穩(wěn) 定是合 理 的 .表 2 pH的影響 pH 4.6 5.5 6.6 8.0 A 4651.3091.3091.2941.312注:甲基橙濃度為 0.05 mmol/L.2.3 磷酸鈉緩沖液對 -PL 與甲基橙反應(yīng)的影響甲基橙測定 -聚賴氨酸 主要 表現(xiàn)在其與 -PL 氨 基陽離子間的反應(yīng) 2 , 磷 酸 鈉緩沖 液可能影響 -PL 結(jié) 構(gòu) 變化 , 這 里考察磷 酸 鈉緩沖 液對 -

12、PL 測定的影響 . 將 -PL 溶于 磷 酸 緩沖 液中 , 并 稀釋成不同濃度進(jìn)行 比色測定 ,考慮 到 -PL 結(jié) 構(gòu) 的變化可能不是 瞬 間 完 成 , 因此 持續(xù)觀察 7d , 觀察磷 酸 鈉緩沖 液對 -PL 測定的影 響 , 試 驗(yàn)期 間配成的溶液在 4 冰箱保 存 . 由表 3可知 , 測定 所 用 磷 酸 鈉緩沖 液對甲基橙法測定 -PL 無 影響 .表 3 磷酸鈉緩沖液對 -PL 測定 A 465的影響 Tab. 3 Effect of sodium phosphate bufferon estimatom A 465 of -PL-PL/g·L-1時(shí)間/d 0.

13、10 0.08 0.06 0.04 1 0.190 0.204 0.222 0.236 2 0.192 0.204 0.222 0.238 3 0.188 0.205 0.224 0.236 4 0.190 0.202 0.224 0.231 5 0.190 0.204 0.220 0.236 6 0.191 0.205 0.225 0.237 70.1910.2060.2200.236-PL 發(fā)酵培養(yǎng)基 8中 主要 的 二價(jià) 陽離子為 Mg 2+, 因此 考察 MgSO 4·7H2O 濃度對甲基橙溶液 A 465的影響 .由圖 2b 中可知 ,當(dāng) MgSO 4·7H2O

14、濃度小于 0.06 g/L時(shí) , MgSO 4·7H2O 濃度對甲基橙的影響可 忽略 不計(jì) . 隨2007年 6月 曹偉鋒 , 等:-聚賴氨酸測定方法的改進(jìn) ·11·MgSO 4·7H2O 濃度的 增 大 , 甲基橙與 MgSO 4·7H2O 反應(yīng)且使 A 465急 劇減小(圖 2a . 因此 , 用甲基橙測定 -PL時(shí) , MgSO 4·7H2O 濃度應(yīng)小于 0.06 g/L. 圖 2MgSO 4·7H2O的影響Fig. 2 Effect of MgSO4·7H 2O-PL 發(fā)酵培養(yǎng)基 8中 主要 的一 價(jià) 陽離

15、子為 NH 4+,這 里考察 (NH4 2SO 4濃度對甲基橙溶液 A 465的影響 .由表 4可知 , (NH4 2SO 4濃度對 比 色測定 -PL 含量 無影響 .表 4 (NH4 2SO 4的影響424(NH 4 2SO 4/g·L-11 2 4 6 8A 4650.247 0.250 0.249 0.252 0.245 0.252注:A 465平均值為 0.249, 相對偏差為 0.125%.-PL 發(fā)酵培養(yǎng)基 8中的 碳源 為 葡萄糖 , 由表 5可知 , 葡萄糖 對 比 色測定 -PL 含量 無 影響 .表 5 葡萄糖的影響葡萄糖 /g·L-1A 465注:A

16、 465平均值為 0.258, 相對偏差為 0.93%.2.5 L-賴氨酸的影響L -賴氨酸為 -PL 的單體 , 考察 L -賴氨酸是 否 與甲基橙反應(yīng) . 由表 6可知 , L -賴氨酸與甲基橙不反應(yīng) .表 6 L-賴氨酸對甲基橙的影響賴氨酸 /g·L-10 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 A 465 0.239 0.240 0.242 0.245 0.242 0.248 0.238 注:A 465的平均值為 0.242, 相對偏差為 1.06%.將 L -賴氨酸溶液 添 加到含 -聚賴氨酸 (0.058 g / L 溶液中 , 與不加賴氨酸的 -聚賴氨酸 樣 品

17、溶液 作 對照 , 觀察 賴氨酸是 否 對 -聚賴氨酸 樣 品測定有影響 . 由表 7可知 , L -賴氨酸對 -PL 測定 無 影響 .表 7 L-賴氨酸對 -PL 測定的影響賴氨酸 /g·L-10 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 A 465 0.186 0.185 0.185 0.186 0.189 0.185 0.186 注:A 465的平均值為 0.186, 相對偏差為 0.46%.2.6 驗(yàn)證綜 合以上試 驗(yàn) 結(jié)果 , 用甲基橙測定 -PL 的測定過 程如下 :甲基橙從水中重結(jié)晶 , 并干燥 至 恒 重 , 實(shí) 驗(yàn)前 溶于 0.1 mol/L磷 酸 鈉緩沖

18、液中 (pH 6.6 ; 將 -聚賴氨 酸的標(biāo)準(zhǔn)品用 0.1 mol/L磷 酸 鈉緩沖 液配成不同濃度 的溶液;將 2 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液與 2 mL 1 mmol/L 甲基橙 溶液 混 合; 所得混 合物在 30 條件下劇烈 振 蕩 , 反應(yīng) 30 min; 然 后 4 000 r/min離心 15 min, 除去產(chǎn) 生的 -PL 與甲基橙形成的復(fù)合物 . 取上清液 1 mL用 磷 酸 鈉緩 沖 溶液稀釋至 50 mL, 在 465 nm處測 吸 光度 . 標(biāo)準(zhǔn) 曲 線 如圖 3.圖 3 -PL 測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 3 Calibration curve for estimation of

19、-polylysine 用 新 建立的方法測定發(fā)酵液中的 -聚賴氨酸含 量 , 得 其 -PL 含量為 2.263 g/L. 向 發(fā)酵液中加入標(biāo)準(zhǔn) 品 , 配成標(biāo)準(zhǔn)品 終 濃度為 2 g/L, 4 g/L, 6 g/L, 8 g/L和 10 g/L的發(fā)酵液 , 用 新 建立的方法測定 新 配成的發(fā)酵液 中 -PL 的含量(減 去 已知 原 發(fā)酵液中 -PL 含量 , 得 其濃度為 1.996 g/L、 3.991 g/L、 6.003 g/L、 7.992 g/L和 10.011 g/L. 比較 用 新 建立方法 所 測 得數(shù) 值與已知加入 的標(biāo)準(zhǔn)品量可知 , 新 建立的方法是準(zhǔn)確可靠的 .

20、(下轉(zhuǎn)第32頁·32·第 22卷 第 2期參 考 文 獻(xiàn):1Mormann W, Brocher M. Liquid crystalline thermosets (LCT from diaromatic mesogenic diepoxides and aromatic diamines: synthesis and phase behaviour of model compounds and intermediate structuresJ. Polymer, 1998, 39(25:65976603.2Farren C, Akatsuka M, Takezawa Y,

21、 et al. Thermal and mechanical properties of liquid crystal-line epoxy resine as a function of mesogen concentration J. Polymer, 2001, 42 (4:15071514.3Sue H J, Earls J D, Hefner R E Jr, et al. Morphology of liquid crystalline epoxy composite matrices based on the diglycidyl ether of 4,4 -dihydroxy-m

22、ethylstilbene J. Polymer, 1998, 39(20:47074714.4Ribera D, Serra A, Mantecon A. New dimeric LC-epoxy -imine monomers with oxyethylene central spacers crosslin-king study J.Polymer, 2003, 44(9 :26212629. 5趙 凌, 王躍川. 超支化聚酯型環(huán)氧樹脂的合成及表征 J. 熱固性樹脂,2003, 18(2:1214.6曹優(yōu)明. 酚基丙烷環(huán)氧樹脂的合成J. 渝西學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2004,3(1:363

23、7.7Choi E J, Ahn H K, Lee J K, et al. Liquid crystalline twin epoxy monomers based on azomethine mesogen:synthesis and curing with aromatic diaminesJ. Polymer, 2000, 41:76177625.8Lee J Y, Jang J, Hwang S S, et al. Synthesis and curing of liquid crystalline epoxy resins based on 4,4biphenolJ. Polymer

24、,1998,39(24 :61216126.9劉振海, 陳學(xué)思. 聚合物量熱測定M. 北京: 化學(xué)工業(yè) 出版社,2002:216218.10李新貴, 黃美榮. 高級液晶聚合物材料工程M. 上海: 華東師范大學(xué)出版社,2000:2425.11金日光, 華幼卿. 高分子物理M. 2版. 北京:化學(xué)工 業(yè)出版社,2000:4647.(上接第11頁 3 結(jié) 論(NH 4 2SO 4、 葡萄糖 、 L -賴氨 酸和 磷 酸鈉 緩 沖液 對 -PL 的 測 定無 影響 , pH 、 MgSO4·7H2O 、 甲基 橙濃 度 等 會 對 -PL 的 測 定 產(chǎn)生影響 . 因此 , 本文 測 定 過

25、程 中 采 用 pH 6.6、 0.1 mol/L磷 酸鈉 緩 沖液來 維持溶 液的 pH , 實(shí)驗(yàn)確 定 選 用的甲基 橙濃 度為 1 mmol/L, 溶 液中 MgSO 4·7H2O 的 濃 度小于 0.06 g/L時(shí)將不 影響 -PL 的 測 定 . 當(dāng)溶 液中 MgSO 4·7H 2O 的 濃 度大于 0.06 g/L時(shí) , 須 將 溶 液進(jìn)行 稀釋 然后 測 定 . 為了準(zhǔn) 確測 定 -PL 的含 量 , 探討 了甲基 橙 與 -PL 反應(yīng)線性 關(guān) 系 , 經(jīng)反復(fù) 測 定 比 較 發(fā) 現(xiàn) , 當(dāng) -PL 濃 度小于 0.1 g/L時(shí) , 線性 關(guān) 系 較 好 , 相 關(guān) 系數(shù) R 2 >0.9. 而文 獻(xiàn) 1,5,6報(bào)道 甲基 橙測 定 -PL 的 方 法 , 未描述測 定 過程 中 MgSO 4