口蹄疫基因工程疫苗研究進展.docx

1、口蹄疫基因工程疫苗研究進展楊生海殷宏張杰'*，劉永生I,陳豪泰I,馬麗娜I,馬艷平)丁耀忠'(1.中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州停醫(yī)研究所家布疫病病原生物學國家重點實驗室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學重點開放實驗室，注席蘭州730046；2.中農(nóng)威特生物科技股份有限公司，甘肅蘭州730046)摘要:介紹了口蹄疫在世界范困內(nèi)暴發(fā)流行的現(xiàn)狀及其疫苗的研究應用，重點綜述了各種口蹄疫基因工程疫苗的研完0-0關(guān)鍵詞：口降疫;晟因工程疫苗；分子生物學;進展中圖分類號:S855.3文獻標識碼:A文章編號：1001-8581(2009)04-0104-05ResearchProgressinGeneticEnginee

2、ringVaccineofFoot-and一mouthDiseaseYANGSheng-hai",yiNHong*,ZHANGJie*,UUYong-sheng',CHENHao-tai*,MALi-na*,MAYan-ping1,DINGYao-zhong'(1.KeyLaboratoryofAnimalVirology,MinistryofAgriculture;StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAg

3、riculturalSciences,Lanzhou730046,China；2.ChinaAgriculturalVeterinarianBiologicalScienceandTechnologyCo.Ltd.,Lanzhou730046,China)Abstract：Thepaperintroducedthecurrentstatusofoutbreakoffoot-and-mouthdiseaseandtheresearchandapplicati(mofthevaccineofthisdiseaseintheworld,andemphaticallysummarizedtherese

4、archprogressesinvariousgeneticengineeringvaccinesoffoot-and-mouthdisease.Keywords:Foot-and-mouthdisease;Geneticengineeringvaccine;Molecularbiology；Progress收稿日期：2009-01-18基金項目：甘諾省科技重大專項計劃項目(0801NKDA034)。作者簡介:楊生海(1978-).男.甘甫慶陽人.助理研究員.碩土研究生.主要從裂病毒分子生物學研究。*通訊作者:張杰。1前言口稀疫(FootandMouthDisease,FMD)是由口蹄疫病毒引

5、起偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，以傳播迅速、感染率高而著稱。FMD易感動物范圍很廣,包括牛、豬、羊等20科約70多種家養(yǎng)和野生動物。FMD一旦暴發(fā)將造成巨大的經(jīng)濟損失，因此世界各國對該病的研究極為重視，國際獸醫(yī)局將其列為A類傳染病之首。隨著經(jīng)濟的發(fā)展,人們生活水平的提高，人們對食品安全的關(guān)注與日俱增，對畜牧產(chǎn)品的質(zhì)械要求日益提高。各國對口蹄疫病均采取了積極措施以防止發(fā)生和防范由國外傳入，而有口蹄疫疾病發(fā)生的國家則不得不進行集中撲殺來控制疫情,并投入了大量的人力、財力研究口蹄疫病的疫苗。由于口蹄疫具有暴發(fā)流行的特點，且造成的經(jīng)濟損失極大，因此口蹄疫疫苗的研制對畜牧業(yè)生產(chǎn)極為重要。預

6、防口蹄疫的傳統(tǒng)疫苗主要為口蹄疫病毒滅活苗或弱毒苗，但存在以下諸多缺點:制劑中不能保證有足夠量的抗原;存在滅活不完全的隱患;需要完善的生物防護設(shè)施,生產(chǎn)成本高;熱穩(wěn)定性差,需要低溫保存,免疫持續(xù)期短,抗病毒譜有限;不能區(qū)分注射疫苗動物和自然感染動物。歐洲某些FMD的暴發(fā)就是由于病毒滅活不完全或疫苗生產(chǎn)實驗室里活的病毒泄漏造成的。這就促使各國學者不斷嘗試研制更加安全、有效的FMD疫苗。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，分子免疫學、分子遺傳學與基因工程技術(shù)的應用,促使對FMD疫苗的研究發(fā)生了革命性的變化o2口蹄疫基因工程疫苗研究進展FMD基因工程疫苗，如亞單位疫苗、可飼疫苗、合成肽疫苗、蛋白質(zhì)載體疫苗、基因缺失疫

7、苗、活載體疫苗、核酸疫苗等防治FMD的新型疫苗應運而生，并且在不斷優(yōu)化。從安全性、高效性、廣譜性、經(jīng)濟性和可操作性上看，基因工程疫苗都有著常規(guī)疫苗不可比擬的優(yōu)勢，它的出現(xiàn)為最終控制并消滅FMD帶來了新的希望。2.1基因工程亞單位疫苗基因工程亞單位疫苗是指采用基因工程手段制備病原體亞單位成份，由于亞單位*疫苗只含有病原體的一部分，不含有核酸，所以不會引起病原體所導致的疾病，其安全性大大提高。20世紀80年代以來,隨著對FMDV抗原結(jié)構(gòu)研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)VP1片段是FMDV的主要抗原位點，能誘導機體產(chǎn)生保護性的中和抗體，并能產(chǎn)生部分保護作用。人們利用各種表達系統(tǒng)以表達FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1J4

8、6S和12S蛋白亞單位等作為抗原制成疫苗，免疫動物均可產(chǎn)生沉淀抗體、補體結(jié)合抗體及中和抗體O1981年,Kupper等克隆了FMDV的VP基因，將其插入到原核表達載體PL啟動子的下游，實現(xiàn)了VP1基因的原核表達，并通過間接ELISA和放射免疫試驗證實了其表達產(chǎn)物具有抗原性,從而為FMDV基因工程亞單位疫苗的研制提供了理論依據(jù)。Vasantha等人用脂質(zhì)體包裹。型和Asia1型FMDV的VP1制備亞單位疫苗，免疫豚鼠產(chǎn)生了高水平的中和抗體，小規(guī)模的田間實驗也取得了比較好的效果。Kield等應用重組DNA技術(shù)首次在大腸桿菌中表達了A型FMDV主要保護性抗原VP1蛋白。以這種融合蛋白制備的實驗疫苗在

9、牛和豬中均可誘導中和抗體產(chǎn)生。使用152昭的融合蛋白重復接種，?？煽笰型FMDV的攻擊感染。Huang等則用含有0-半乳糖昔酶和一個完整的FMDVVP1蛋白主要抗原決定簇的重組融合蛋白接種豚鼠和豬，可以產(chǎn)生特異性的中和抗體，并起到有效的保護作用。在Morgan的實驗中，用A12-32二聚體多次接種豬，豬也可產(chǎn)生高水平的中和抗體,可以保護豬免受強毒的攻擊，但是該技術(shù)不適合0型FMDV。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FMDV結(jié)構(gòu)基因和非結(jié)構(gòu)基因24、3C串聯(lián)起來表達，可以產(chǎn)生76S的類病毒粒子，提純該類病毒粒子用來免疫動物，其免疫效果類似于全病毒，可產(chǎn)生高水平的中和抗體，能抵抗強毒的攻擊,并徹底解決了FMDV常規(guī)

10、疫苗散毒的危險，顯示出良好的應用前景。除此以外,酵母和桿狀病毒系統(tǒng)也可用于表達FM-DV抗原蛋白，解決目的蛋白在原核表達系統(tǒng)中不被修飾加工等問題，以期提高其免疫原性。目前，已用大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞、桿狀病毒、植物生物反應器等表達系統(tǒng)表達了FMDV的部分結(jié)構(gòu)蛋白或全部結(jié)構(gòu)蛋白。從表達產(chǎn)物的免疫活性來看，真核表達產(chǎn)物要好于原核表達產(chǎn)物。2.2可飼疫苗近些年來,隨著植物基因工程的快速發(fā)展，植物也被用作生產(chǎn)包括疫苗及藥物等一系列蛋白的生物反應器，成為植物基因工程領(lǐng)域內(nèi)的一個研究亮點。利用轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)生產(chǎn)疫苗，是將微生物或病毒的抗原基因?qū)胫参?，使其在植物中表達，當人或動物攝入這種植物或其抗原

11、蛋白后，即可產(chǎn)生對這種抗原的免疫應答。關(guān)于利用轉(zhuǎn)基因植物作為生物反應器生產(chǎn)疫苗較早的報道出現(xiàn)在由Mason等在1992年的關(guān)于人類乙型肝炎表面抗原在轉(zhuǎn)基因植物中的表達中,之后又有許多相關(guān)的報道?；蛑参镆呙缇哂幸韵聝?yōu)點:（1）易于形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模,在篩選到高效表達植株后,只需增加耕種面積就能擴大其產(chǎn)量;（2）價格便宜,因為植物易于栽培和管理；（3）相對安全，植物病毒不會感染人類和家畜;（4）使用方便。目前，已經(jīng)獲得擬南芥、煙草、苜蓿等的轉(zhuǎn)基因植株。Wigdororiz等（1999年）將FMDV-VP結(jié)構(gòu)蛋白基因成功地插入到煙草花葉病毒（TMV）U基因組中,重組的TMV接種本塞姆氏煙草和苜蓿。We

12、stern印跡分析表明，每1g新鮮葉子中含有VP1結(jié)構(gòu)蛋白50150期,利用葉子提取物對豚鼠進行免疫學試搶，結(jié)果顯示其能誘導動物產(chǎn)生特異性免疫應答。但是，目前應用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)疫苗也有不足之處。首先，外源基因在植物中的表達量問題，在現(xiàn)有的研究中,外源基因所表達的重組蛋白大約只占植物中可溶性蛋白的0.01%。.37%,即使以高表達髭者為標準，作為疫苗，這個表達量仍然較低。但這可以通過改進表達調(diào)控系統(tǒng)，如采用強啟動子、增強子、先導序列及調(diào)控序列來促進表達;其次,關(guān)于轉(zhuǎn)基因植物可食化疫苗的免疫原性問題，在人和小鼠的食用試驗中，粘膜分泌性抗體的檢出率分別為50%和10%，作為可食化疫苗顯然是不理想的。

13、因此，有兩個因素應該考慮和研究,一是植物本身可能含有一些因素會影響或干擾重組蛋白的免疫原性,這需要進一步研究，并找出解決途徑;二是重組蛋白在經(jīng)歷胃腸消化酶的作用后，可能發(fā)生降解或被破壞,從而影響其免疫原性?？蛇x擇的解決途徑是在抗原基因旁加上修飾基因或吸附基因序列（如菌毛蛋白基因），或?qū)⒖乖M裝成病毒顆粒樣的有序結(jié)構(gòu),以增強抗消化作用。預計未來的轉(zhuǎn)基因宿主將呈現(xiàn)多樣化的局面，以滿足不同動物的需求O2.3活載體疫苗利用基因操作技術(shù)將FMDV的主要抗原基因插入某種缺陷性病毒的基因組中構(gòu)建成重組病毒，這種病毒可感染哺乳動物細胞并在細胞內(nèi)表達FM-DV的抗原蛋白，刺激機體產(chǎn)生免疫反應。另外，針對FMDV

14、多血清型且各血清型之間無叉保護作用的特性，可以將不同型FMDV的VP1或P1基因插入到同一病毒活載體中，從而組成多價基因工程疫苗來預防、控制FMD及其他相關(guān)疾病。目前，用于表達FMDV抗原的病毒載體主要有痕苗病毒、腺病毒、皰疹病毒、核心多角體病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、牛鼻氣管炎病毒、牛瘟病毒及煙草花葉病毒等"°）。2000年,Berinstein以痘苗病毒為載體構(gòu)建重組FM-DV,表達FMDVC3Arg85株衣殼蛋白前體Pl基因，免疫后可檢測到高水平的FMDV和痘苗病毒的中和抗體，類似于滅活疫苗免疫所產(chǎn)生的抗體水平。經(jīng)小鼠免疫實驗表明:重組痘苗病毒抗FMDV的有效免疫原可以作為

15、活載體疫苗川。Kit等利用牛傳染性鼻氣管炎病毒表達了FMDV結(jié)構(gòu)蛋白的VP1多肽,用該重組病毒接種牛誘導產(chǎn)生了高水平的抗FMDV抗體。目前FMDV腺病毒活載體疫苗的研究已取得了較大的進展，有望在不久的將來應用于FMD防治。GregoryA等用表達FMDV結(jié)構(gòu)蛋白腺病毒VI型免疫豬,4周后用相同劑量加強免疫1次，產(chǎn)生了高水平的FMDV中和抗體,5/6的免疫豬得到完全保護。Sanz等將編碼衣殼蛋白前體P1的cDNA基因插入到復制型人5型腺病毒（Ad5wt）載體中。用重組的FM-DV而5-P1經(jīng)皮下或鼻內(nèi)接種到牛體內(nèi)，在第2次免疫后，鼻內(nèi)接種FMDV進行攻毒。雖然未檢測出抗FMDV抗體，但經(jīng)2次皮下

16、接種重組病毒的所有動物均得到有效的保護。另外,Mayr等也構(gòu)建了2株表達FMDV衣殼蛋白P1-2A和3C蛋白酶基因的非復制型人5型腺病毒載體AH5-P12X3CWT和Ad5-P12X3CMUT。其中在Ad5-P12X3CMUT的3C蛋白酶編碼區(qū)進行了點突變。結(jié)果只有在3CWT病毒感染的細胞中,FMDV的衣殼蛋白能被加工成成熟蛋白VPO.VP3和VP1。重組病毒經(jīng)肌肉接種小鼠后，只有3CW病毒能誘導FMDV特異性中和抗體反應。接著，他們用1xIO。PFU的Ad5-P12X3CWT肌肉接種豬,1個月后用5x108PFU加強,然后進行強毒攻擊。結(jié)果使5/6的攻毒豬得到保護，并使其余豬的癥狀表現(xiàn)較輕。

17、后來,他們又證明用1xlO9PFU的Ad5-P12X3CWT次免疫就能達到兩次免疫的效果，這顯示出了良好的應用前景仲O金寧一等將FMDV衣殼蛋白PI-2A和蛋白前3C基因單一或共同插入到雞痘病毒載體pUTA-2和pUTA-16LacZ中,構(gòu)建了重組雞痘病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒pU-TA2PI和PUTAL3CPIO應用2株重組雞痘病毒株免疫小鼠，經(jīng)對免疫小鼠脾細胞中T細胞亞類計數(shù)、脾細胞CTL殺傷活性以及FMDV抗體的檢測，證明了這2株重組雞痘病毒可以誘導小鼠產(chǎn)生明顯的細胞免疫和體液免疫反應許多學者對活載體疫苗寄予了很大的希望，希望通過共表達一些T細胞位點和細胞因子而使活載體疫苗的免疫效力進一步提高。但

18、迄今為止，重組病毒疫苗仍然處于研究和探索階段。與常規(guī)滅活疫苗相比較，在基因表達效率及表達產(chǎn)物的修飾與加工、與天然產(chǎn)物的生物學活性的一致性等方面值得進一步探討。2.4基因缺失疫苗運用基因工程手段克隆口蹄疫病毒全長cDNA,構(gòu)建感染性克隆，在DNA水平上來操作RNA,通過缺失與毒力相關(guān)的基因，減弱其毒力但不喪失其免疫原性?？谔阋卟《颈砻娓叨缺Ｊ氐腜環(huán)（G-H環(huán)）上的精氨酸-甘氨酸-天門冬氨酸（RGD）序列，構(gòu)成病毒的細胞吸附位點。構(gòu)建缺失或取代RGD序列的感染性的cDNA克隆，轉(zhuǎn)染BHK細胞，產(chǎn)生缺失或突變的RGD序列的病毒粒子，這種缺失RGD序列的病毒粒子不吸附和感染細胞。以該缺失病毒進行小鼠和

19、豬的動物試驗發(fā)現(xiàn)，野生型病毒對照組發(fā)現(xiàn)典型的口膝疫癥狀,缺失病毒試驗組無任何癥狀。用海福特牛對這種缺失病毒所做的油佐劑苗進行免疫試驗，并與常用的BEI（二乙烯胺）滅活苗作比較，證明了在產(chǎn)生血清中和抗體、刺激機體產(chǎn)生免疫應答、動物保護等方面與滅活疫苗一致。2.5合成肽疫苗合成肽疫苗即用根據(jù)免疫抗原表位的氨基酸序列合成的抗原決定基小肽制作的疫苗。一般是從蛋白質(zhì)的-級結(jié)構(gòu)并結(jié)合單克隆抗體的分析，推導出蛋白質(zhì)免疫主要抗原表位的賽基酸順序，然后合成或基因工程表達這一段肽作為抗原。它們具有純度高、穩(wěn)定性好、易保存、可大址生產(chǎn)、副作用小、使用安全等優(yōu)點,近些年來得到了廣泛的重視"句ODimarch

20、用合成O1K病毒VP1的141-158和200213片段氨基酸蛆成的40個氨基酸肽（半胱氨酸-半胱氨酸-200-213-脯氨酸-脯燹酸-絲氨酸-141-158-脯氨酸-半胱氨酸-昔氨酸），在其中間加上2個脯氨酸和1個絲氨酸,使多肽折成立體構(gòu)型，大大提高了單段肽（141-158-脯氨酸-半胱氨酸-昔氨酸）在豚鼠中的應答水平，并提出了VP1段基端氨基酸（半胱氨酸-半胱氨酸）在提高保護應答中的重要性。Brown等用化學法合成了FMDVVP基因編碼的140-160及200-213位肽段的基因片段,并在大腸桿菌體內(nèi)得到了表達，用其免疫牛、豬等都獲得了較好的免疫力。Doel分別用A、O、C血清型FMDVV

21、P1序列的141158和200-213肽段組成的40個氨基酸合成肽，用牛和豚鼠進行了試驗,結(jié)果每個肽都產(chǎn)生了特異性高水平抗病毒中和抗體，在豚鼠中0、A型肽可抗各自病毒的攻擊并獲得完全保護，但C型的效果較差。KupriianovaMA等應用44-63個氨基酸，即FMDV-A22株VP基因第135159J70190和197-213位氨基酸所構(gòu)建的合成肽疫苗,通過免疫豚鼠和小鼠,證明了相對于含有較少氨基酸的合成肽來說,其免疫效果有顯著的提鏟。合成肽疫苗的免疫原性基于它們能遞呈VP1蛋白G-H環(huán)上關(guān)鍵的抗原表位。然而，這些抗原位點不僅不是病毒粒子上唯一的中和性位點，而且也不一定能被所有的宿主動物識別，

22、這導致了這些疫苗在大規(guī)模使用時候，效果并不理想。如Taboga等在138頭牛進行4種合成肽疫苗的效果評價時,發(fā)現(xiàn)各免疫組雖可產(chǎn)生相應的免疫反應，甚至高水平的中和抗體，但它們對免疫動物的攻毒保護率均在40%以下。此外，由于FMDV的MHCII型的多態(tài)性、免疫系統(tǒng)對合成肽的提呈以及RNA病毒本身高度的變異性等多種因素，僅使用人工合成的結(jié)構(gòu)簡單的抗原分子很難與完整的病毒抗原分子相比較，往往不能獲得理想的免疫效果。再加上合成肽的分子較小,空間構(gòu)象簡單，因而對免疫系統(tǒng)的剌激強度和識別信號不夠，不僅難以產(chǎn)生針對高度變異的小RNA病毒的保護作用，相反還有利于抗原變異株的選擇性適應。這不僅不能有效地誘導保護性

23、免疫，還會加速病毒的變異速度。如Taboga等就在未保護的牛中分離到突變逃逸株網(wǎng)。通過改進合成肽疫苗的B細胞表位，添加FMDV結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白中的T細胞表位來合成多肽復合體，以模擬與FMDV中和抗體產(chǎn)生有關(guān)的形態(tài)表位,或者應用盡可能覆蓋所有變異株的多肽復合物來免疫動物,盡可能減少變異株的產(chǎn)生。總之，如何增強FMD合成肽疫苗的免疫效果，體外合成的肽能否有效代替體內(nèi)自身合成肽進行免疫等許多問題，需要進一步搞清FMD的分子免疫機制才能得以解決。2.6核酸疫苗（DNA疫苗）核酸疫苗也稱基因疫苗、裸DNA疫苗，將編碼基因的質(zhì)粒DNA直接導入動物肌細胞內(nèi)，通過宿主細胞的轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)合成抗原蛋白，能在體內(nèi)表

24、達抗原并誘導機體產(chǎn)生免疫應答，最終達到免疫的目的。核酸疫苗有許多優(yōu)點:基因疫苗的接種能全方位地調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，誘導出針對保護性抗原的特異性體液和細胞免疫應答，既具有弱毒疫苗的高效性又具有滅活苗的安全性，同時又能避免這兩種疫苗的缺點，加之穩(wěn)定性好、無感染因子、較易規(guī)模化生產(chǎn)。因此，成為該領(lǐng)域的研究熱點。早在20世紀70年代末，人們就證實了動物體細胞具有攝取裸露DNA分子的能力。WanlG等渺）構(gòu)建了在巨細胞病毒（CMV）早期啟動子調(diào)控下,攜帶有412-FMDVVP1的DNA疫苗。HuangH等,利用豬IgG序列融合蛋白基因構(gòu)建的DNA疫苗，在不同的早、晚期啟動子控制下，接種豚鼠均可誘導中和抗

25、體的產(chǎn)生和脾細胞的增殖，但未見到保護作用。后來,Bean!等構(gòu)建了兩個不同的質(zhì)粒。一個質(zhì)粒pP12X3C攜帶有FMDV衣殼蛋白前體基因P1和蛋白酶3C,用基因槍將該質(zhì)粒接種動物可檢測到特異性的體液反應。第二個DNA質(zhì)粒pWRMHX攜帶有編碼完整個病毒基因組（但刪除了細胞結(jié)合位點），用該質(zhì)粒接種豬后可以產(chǎn)生病毒樣粒子并誘導產(chǎn)生中和抗體。比較兩種質(zhì)粒PP12X3C和pWRMHX接種豬后，結(jié)果顯示:攜帶有復制病毒基因組的質(zhì)粒DNA可以產(chǎn)生較強的免疫力，應用pWRMHX經(jīng)肌肉注射、鼻內(nèi)接種和基因槍途徑接種的豬均對強毒攻擊產(chǎn)生部分保護力。Wong等細構(gòu)建pCEIM和pCEIS兩個質(zhì)粒，它們分別串聯(lián)有FM

26、DV的VP1基因的主要抗原位點基因（氨基酸殘基的第141160和200213位氨基酸）和鼠及豬的免疫球蛋白基因。將它們分別接種于小鼠（腹部皮下）和豬（耳背部皮下），前者可刺激小鼠產(chǎn)生特異性的T淋巴細胞增殖和中和抗體,后者經(jīng)2次免疫的豬也出現(xiàn)了T淋巴細胞增殖（SI可達8.1）,并產(chǎn)生高效價的中和抗體。在攻毒實驗中，應用pCEIS進行免疫的豬可全部保護而不發(fā)病。2.7空衣殼疫苗研究發(fā)現(xiàn)，病毒的部分結(jié)構(gòu)蛋白可在細胞內(nèi)自行裝配成為一種不含病毒核酸的空殼結(jié)構(gòu)，這種空殼結(jié)構(gòu)被稱為病毒樣顆粒（VLPs）。VLPs具有與真實的病毒粒子相似的結(jié)構(gòu),可以模仿病毒感染途徑呈遞給免疫細胞,從而有效地誘導機體的免疫系統(tǒng)

27、產(chǎn)生免疫保護反應。近年來利用VLPs表達技術(shù)研制安全、高效的空衣殼疫苗，已經(jīng)成為疫苗研究中的一個熱點?？找職ひ呙缰饕幸韵聝?yōu)點2,3:（1）它模擬了真實病毒粒子結(jié)構(gòu)，擁有與滅活或者弱毒疫苗一樣的衣殼蛋白,但不含有病毒的致病核酸成分。（2）缺乏病毒的DNA或RNA,不存在與野毒重組的問題。（3）空衣殼疫苗相對于普通亞單位疫苗而言需要更少的免疫原就可以刺激產(chǎn)生相似的保護性免疫反應。（4）除了可以刺激B細胞介導的體液免疫外，還可以刺激產(chǎn)生CD4和CTL,這一特點可能對其發(fā)揮高效率的免疫起重要作用。目前主要通過以下兒種表達系統(tǒng)表達目的基因以獲得VLPs：各種哺乳動物表達系統(tǒng)，通過境時表達或者穩(wěn)定表達的

28、方式;桿狀病毒表達系統(tǒng);各種類型的酵母，.如SaMtarwnycescerevis血、pichiapcuto屋;大腸桿菌等細菌;各種植物生物反應器等。不同的病毒需要根據(jù)病毒自身的特點選擇合適的表達系統(tǒng)及策略以獲得理想的結(jié)果。衣殼是由單一的結(jié)構(gòu)蛋白聚合而形成的病毒，由單一的結(jié)構(gòu)蛋白形成病毒衣殼的無囊膜病毒研制VLP疫苗相對簡單,如乳頭痛病毒、細小病毒、杯狀病族、圓環(huán)病毒等。其中人乳頭瘤病毒（HPV）VLP疫苗研究最為成功。通過將主要衣殼蛋白前導蛋白L1在哺乳動物細胞、昆蟲、和酵母中表達,產(chǎn)生的VLPs被證明是安全和有效的。在臨床實驗前進行的動物實驗中,給小鼠、兔及猴注射低劑量的111MJVLP后

29、，可產(chǎn)生較高滴度的中和抗體，這種中和抗體在體外可較好地中和HPV或假病毒。利用兔、狗、牛進行的實驗表明，經(jīng)腸道外免疫VLPs后，產(chǎn)生的抗體能較好的保護機體抵抗高劑量病毒的攻擊O衣殼是由多個結(jié)構(gòu)蛋白相互作用而形成的病毒，有些病毒的衣殼是由多個蛋白亞單位相互作用形成的，這類病毒的VLPs的獲得比單一的只有主要衣殼蛋白構(gòu)成的病毒的VLPs要復雜得多。一般采用通過與衣殼組裝相關(guān)的多個蛋白在同一細胞中共表達或表達一個多聚前體蛋白，使其自裂解后組裝VLPs的方式獲得。VLP疫苗比單一的病毒蛋白更有利于誘導機體產(chǎn)生免疫反應。此外，利用桿狀病毒、痘病毒、腺病毒等載體表達FMDV的PL2A與3C蛋白酶基因或者整

30、個病毒基因,表達產(chǎn)物可以組裝成病毒空衣殼結(jié)構(gòu)。用這種空衣殼制備成疫苗免疫動物取得了比較理想的保護效果?？找職ひ呙缡且环N能夠剌激機體產(chǎn)生體液和細胞免疫的新型基因工程疫苗。它比那些具有核酸物質(zhì)的活病毒疫苗更安全，而且因為它的結(jié)構(gòu)更接近于真實的病毒,所以比普通的亞單位疫苗更有效。3結(jié)語疫苗接種是控制FMD最重要的措施之一，評價一種疫苗優(yōu)劣的指標主要包括安全性、效力、生產(chǎn)和使用方便程度及疫苗生產(chǎn)需要成本的高低等。傳統(tǒng)疫苗在這些方面均存在一定的不足。隨著分子生物學和基因工程技術(shù)的發(fā)展，新型疫苗的研究已經(jīng)取得了較大的發(fā)展，特別是在生產(chǎn)的安全性方面,新型疫苗已經(jīng)取得了超過傳統(tǒng)疫苗的優(yōu)勢°)。

31、9;FMD基因工程疫苗的研究是綜合性的工程,要想在FMD基因工程疫苗上取得實際的應用價值，這不僅需要對FMDV分子生物學相關(guān)方面的深入研究，而且還要對FMDV的免疫機理，尤其是對黏膜免疫的分子機制有全面的認識?？上驳氖?許多國家已投入大量的人力、物力和財力用于該方面的研究，并且取得了一定的成果。參考文獻：1 股震,劉景華.動物病毒學(第二版)M.北京:科學出版社，1997.479-499.2 RobertoMateo,EvaLuna,Ver6nicaRinc6n,etal.EngineeringViableFoot-and-MouthDiseaseViruseswithIncreasedThe

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