正交優(yōu)選連翹中齊墩果酸的提取工藝

1、正交優(yōu)選連翹中齊墩果酸的提取工藝         【摘要】  目的優(yōu)選連翹中齊墩果酸的提取工藝。方法以齊墩果酸含量為指標(biāo)，采用L9(34)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，考察了提取時(shí)間、乙醇濃度、料液比對(duì)提取率的影響,優(yōu)選出合理的提取工藝。用高效液相測定齊墩果酸的含量。結(jié)果優(yōu)選出齊墩果酸的最佳提取工藝條件是：超聲提取3次，40 min/次，90%乙醇溶液，料液比112。結(jié)論采用此工藝提取方法快速、簡單，可以為進(jìn)一步研究連翹提供參考。 【關(guān)鍵詞】  正交實(shí)驗(yàn) 齊墩果酸 連翹Abstract：ObjectiveTo

2、optimize the extraction condition of oleanolic acid from  Fructus ForsythiaeMethodsWith oleanolic acid as index，extraction time、concentration of alcohol and amount of alcohol and were evaluated by L9(34)orthogonal design methodHPLC was used to analyze the content of oleanolic acidResultsThe opt

3、imum extraction condition was described as follow：ultrasonic extraction 3 times (once 40 min)，90% ethanol solution, and 12-fold solventConclusionThe optimized technology is quick and simple，and can be used for theoretical basicKey words：Orthogonal design;   Oleanolic acid;   Fruc

4、tus Forsythiae   中藥連翹是木犀科連翹屬植物的干燥果實(shí)，主產(chǎn)山西、河南、陜西,有廣譜的抗菌作用，如對(duì)金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、綠膿桿菌等有不同程度的抑制作用，有鎮(zhèn)吐、解熱、抗炎以及保肝作用，含有連翹苷、牛蒡子苷、齊墩果酸等1。齊墩果酸具有降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶的活性、促進(jìn)細(xì)胞再生、防止肝硬化、抗炎等作用，是治療肝炎的有效成分。近年有關(guān)研究證明其有抗癌活性。       中國藥典2對(duì)連翹中的連翹苷進(jìn)行了測定；孫國祥等3對(duì)連翹的HPLC指紋圖譜進(jìn)行了研究；張杲等4對(duì)不同采收期連翹進(jìn)行了HPLC

5、指紋圖譜研究；鄒盛勤5對(duì)不同采收期連翹中的熊果酸和齊墩果酸含量進(jìn)行了測定；張濤等6對(duì)連翹不同炮制品中連翹苷進(jìn)行了HPLC測定。   本工藝以齊墩果酸的含量作為考察指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相結(jié)合，用HPLC測定，優(yōu)選連翹中齊墩果酸的提取工藝，以期為進(jìn)一步研究連翹奠定基礎(chǔ)。1   儀器與試藥1   儀器日本Hitach公司高效液相色譜儀；L-2400型紫外檢測器；Gold Spectrumlab 54 紫外可見分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)；KQ2200E型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)； PH-030干培兩用箱（上海

6、一恒科技有限公司）；RE - 52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）； Sartorius十萬分之一電子天平(德國)。 2   試藥藥材連翹購自江西省藥材公司(產(chǎn)地山西)，經(jīng)江西醫(yī)學(xué)院馮江教授鑒定為正品連翹；齊墩果酸對(duì)照品由中國藥品生物制品檢驗(yàn)所提供；甲醇為色譜純,超純水；其他試劑均為分析純。2  方法與結(jié)果2.1   色譜條件Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm,5 m）；流動(dòng)相為甲醇-水-0.1%冰醋酸（9280.1，V/V/V）；柱溫：30；流速1 mL/min；檢測波長215 nm。2.2

7、60;  檢測波長的確定取對(duì)照品溶液，經(jīng)紫外分光光度計(jì)在200500 nm范圍內(nèi)掃描得知，對(duì)照品溶液在203，207，210 nm等處有吸收，但由于流動(dòng)相在短波長處有末端吸收，為了減少干擾, 因此選擇最大的215 nm作為測定含量的吸收波長。2.3  對(duì)照品溶液的制備  取對(duì)照品105恒溫干燥至恒重，精密稱取10.3 mg齊墩果酸對(duì)照品，置10 ml容量瓶中，用流動(dòng)相溶解，超聲5 min，定容至10 ml，得到1.03 mg/ml的對(duì)照品溶液。2.4   標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍的考察 依次精密吸取對(duì)照品溶液0.1，0.5，2，3，4 ml后，置10

8、 ml容量瓶中，再加10 ml流動(dòng)相溶解稀釋，分別取10 l進(jìn)樣3次，記錄峰面積，以峰面積值(Y)對(duì)齊墩果酸的濃度(X )進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=3 980 023X-28 536, r=0.999 8。結(jié)果表明齊墩果酸在0.010.4 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.5  單因素實(shí)驗(yàn)         表1  因素水平（略）2.6   供試品溶液的制備及正交實(shí)驗(yàn)把連翹藥材研碎，過40目篩，取恒溫干燥至恒重的連翹藥品，精密稱取1g 9份，按表2設(shè)計(jì)先用石油醚脫脂2次，棄

9、去石油醚，烘干，然后把藥渣用乙醇溶液冷浸1 h，超聲提取3次，過濾，合并濾液，蒸干，用流動(dòng)相溶解、超聲，過0.45 m微孔濾膜，定容于10 ml容量瓶中，各取10 l分別進(jìn)樣3次，記錄峰面積，用面積外標(biāo)法測定齊墩果酸的含量。見表2。表2  正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(L9(34)及極差分析（略）從極差的分析結(jié)果知道，RARBRC，超聲時(shí)間A的R值最大，也就是超聲提取的時(shí)間影響最大，其次是濃度，影響最小的是料液比，因此較好的工藝條件是A2B3C3，即超聲40 min，乙醇濃度是90，料液比為116，此時(shí)得到齊墩果酸的含量最大。為了進(jìn)一步分析因素的可信度，還得進(jìn)行方差分析。見表3。 

10、0;從方差分析結(jié)果來看，超聲的時(shí)間是最顯著因素，其次是乙醇濃度，最后是料液比。因此，提取過程中，應(yīng)把超聲時(shí)間作為關(guān)鍵因素考慮，然后是乙醇濃度和料液比。表3   方差分析（略）2.7  方法學(xué)考察3  討論   從正交實(shí)驗(yàn)的結(jié)果及多次實(shí)驗(yàn)知道，料液比為112和116兩者所得到的結(jié)果沒多大區(qū)別，從考慮節(jié)約角度來說，選取112較好，因此最佳的提取工藝是超聲3次，40 min/次，乙醇的體積分?jǐn)?shù)是90%，料液比為112。   從熱回流、冷浸、索氏提取幾種提取方法比較來看，同樣條件下，超聲所得的含量最大，且簡單易行，因此選擇超聲作為提取的研究方法。   因?yàn)檫B翹中還含有熊果酸，要分離齊墩果酸和熊果酸這對(duì)異構(gòu)體，從Alltech ODS和KromasilC18分離的效果來看，C18分離效果較好，故選擇了KromasilC18，加冰醋酸可提高兩者的分離能力?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 鄭漢臣，蔡少青.藥用植物學(xué)與生藥學(xué)，第4版 M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005:360.2 國家藥典委員會(huì). 中國藥典, 2005，部S. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社,2005: 117.3 孫國祥,慕善學(xué),侯志飛,等. 連翹的HPLC指紋圖譜研究J.中成藥，2007，29（2）：161.4 張 杲,李發(fā)榮,段 飛