植物組培污染菌種類初探

1、江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 畢 業(yè) 設(shè) 計(jì)（論 文）SNL/QR7.5.4-3 植物組培中污染菌初探專 業(yè) 生物技術(shù)及應(yīng)用 學(xué)生姓名 沈 永 恒 班 級 14生物技術(shù)及應(yīng)用1班 學(xué) 號 201411130119 指導(dǎo)教師 宋 剛 完成日期 2017年6月 成績評議學(xué)號201411130119姓名 沈永恒 題目 植物組培中污染菌初探 指導(dǎo)教師建議成績： 評閱教師建議成績： 答辯小組建議成績： 院答辯委員會評閱意見及評定成績：答辯委員會主任簽字（蓋章）： 年 月 日畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）任務(wù)書姓名沈永恒學(xué)號201411130119班級14生物技術(shù)及應(yīng)用1班題目植物組培中污染菌種類初探 設(shè)計(jì)(論文)主要內(nèi)容本文

2、主要研究在植物組培中污染菌的種類、引起污染的原因以及防治的方法。重點(diǎn)研究問題污染菌種類以及防治污染的方法主要技術(shù)指標(biāo)死對頭其它要說明的問題指導(dǎo)老師意見 指導(dǎo)教師簽字： 年 月 日指導(dǎo)教師意見 對論文的簡短評價(jià)：1.指出論文存在的問題及錯(cuò)誤2.對創(chuàng)造性工作評價(jià)3.建議成績 優(yōu) 良 中 及格 不及格 指導(dǎo)教師簽字 年 月 日評閱教師意見 對論文的簡短評價(jià)：1.指出論文存在的問題及錯(cuò)誤2.對創(chuàng)造性工作評價(jià)3.建議成績 優(yōu) 良 中 及格 不及格 評閱教師簽字 年 月 日答辯小組評議意見學(xué)號201411130119姓名 沈永恒 題目 植物組培中污染菌初探 答辯小組意見： 1、對論文的評價(jià)2.建議成績等級

3、 優(yōu) 良 中 及格 不及格3.需要說明的問題 答辯小組長簽字 年 月 日植物組培中污染菌初探（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院 句容 212400）摘要：本文主要?dú)w納了在植物組織培養(yǎng)中的污染菌類型、特征以及引起污染的原因和防治污染的方法。文章中主要是細(xì)菌類污染、真菌類污染以及病毒類污染，其中以真菌類污染比較常見。本文還給出了防止污染的方法，僅供參考。關(guān)鍵詞：植物組培；污染；污染防治A preliminary study on the species of contaminated bacteria in plant tissue culture (Jiangsu Polytechnic College o

4、f Agriculture and Forestry, Jurong, Jiangsu 212400)Abstract: This paper mainly summarizes the types of bacteria contamination in plant tissue culture method, causes and prevention and control of pollution caused by pollution characteristics as well. The article is mainly bacteria pollution, fungi po

5、llution and viral contamination, the fungi pollution is relatively common. This paper gives a method to prevent pollution, for reference.Key words: plant tissue culture; pollution; pollution control目 錄1.引言12. 植物組培污染原因12.1離體植物自身的污染12.2外在環(huán)境的污染13. 植物組培污染微生物種類13.1真菌23.2病毒23.3細(xì)菌34.植物組培污染防治方法3 4.1對接種人員的要求

6、4 4.2對接種環(huán)境的要求44.3對器具的要求44.4對培養(yǎng)基的要求54.5對培養(yǎng)瓶的要求54.6對接種材料和接種環(huán)境的要求54.6.1對外植體的消毒54.6.2加入抗生素64.6.3操作間的消毒65.結(jié)束語6參考文獻(xiàn)7致謝81引言隨著科技的發(fā)展，植物組培技術(shù)越來越受到人們的重視，也發(fā)揮著越來越大的作用。植物工廠化的育苗、挽救瀕臨滅絕的珍貴植物、減少病蟲害、完善基因庫等等都離不開植物組培這一重要技術(shù)。雖然植物組織培養(yǎng)操作是在無菌環(huán)境中完成的，但是也因?yàn)橥庵搀w帶菌、滅菌不徹底、操作不規(guī)范等錯(cuò)誤帶來一系列的污染。污染帶來的危害有很多，比如導(dǎo)致初代培養(yǎng)失敗，繼代培養(yǎng)增殖系數(shù)低，試管苗死亡或者是生長速

7、度慢，玻璃化加劇，移栽困難，成活率低，甚至失敗1。對于工廠化生產(chǎn)加大了工廠化生產(chǎn)的成本、減少了利潤、延誤了時(shí)間、浪費(fèi)了資源、延緩了工作效率等。 植物組織培養(yǎng)是利用細(xì)胞全能性的特點(diǎn)，在無菌條件下，將離體的植物的器官、組織、原生質(zhì)體培養(yǎng)于人工調(diào)配的適合生長的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中生根、分化、增殖最后形成完整植株的過程。植物組培的接種、培養(yǎng)苗的轉(zhuǎn)移和繼代等都是在無菌的環(huán)境下進(jìn)行。無菌環(huán)境的好與壞滅菌時(shí)間的長短都是造成污染的主要原因，這也是研究和工廠化生產(chǎn)的關(guān)鍵所在。因此，保證培養(yǎng)材料和培養(yǎng)基的無菌狀態(tài)及培養(yǎng)室的良好清潔條件，是植物組培成功的最基本的前提2。2植物組培污染原因植物組培污染是指培養(yǎng)物在培養(yǎng)

8、過程中因溫度、PH值、濕度、光照、合適的營養(yǎng)條件等符合其他微生物生長，不利于組培苗生長的，導(dǎo)致在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生一系列污染。這些污染一般出現(xiàn)在材料表面、材料附近的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)基的其他部位，表現(xiàn)為霉變、混濁或云霧狀、粘液狀、發(fā)酵泡沫狀等不同形狀、顏色和大小的污染痕跡 3。2.1離體植物自身的污染植物組培中的培養(yǎng)材料大部分都是從自然界天然的環(huán)境中選取的，有的取自土壤表面，有的則是取自土壤的表面以下部分，有的取自于樹木及花草等。例如：植物的莖葉、馬鈴薯、植物的果實(shí)或種子。在取材料的過程中往往會出現(xiàn)意外損傷培養(yǎng)材料的表面，使空氣中的孢子或者是土壤中的微生物菌進(jìn)入了培養(yǎng)材料的內(nèi)部而引起的污染。2.2外在

9、環(huán)境的污染由于接種室內(nèi)空氣滅菌不徹底使其室內(nèi)帶菌量太大，接種人員的手部清洗不干凈、隨意大聲講話和培養(yǎng)基滅菌不當(dāng)導(dǎo)致的不同程度的污染。3植物組培污染微生物種類在植物組培過程中，導(dǎo)致污染的病原菌種類大致分為真菌類、病毒類以及細(xì)菌類。在這三類中真菌和細(xì)菌類占的比例比較大。詳見下圖1圖1.植物組培污染比例圖（引自百度圖片）3.1真菌圖2.真菌污染圖真菌是沒有葉綠素的真核微生物，除少數(shù)種類是單細(xì)胞外,絕大多數(shù)是由多細(xì)胞組成的。真菌在地球上廣泛存在于空氣、水、土壤以及各類生物的體表或體內(nèi)。在室內(nèi)常附著在物體表面，能自動或隨人的活動而擴(kuò)散于四周。真菌種類豐富，分布廣泛，繁殖快速，無處不在。真菌污染在培養(yǎng)基中

10、是呈絨毛狀、絮狀，界限不太明顯，有許多不同顏色的孢子，在接種后的4-8天內(nèi)開始從外植體處長白毛。真菌污染在培養(yǎng)過程中是最多的。真菌喜歡溫暖潮濕的環(huán)境，而培養(yǎng)基恰恰給它提供了這樣的環(huán)境，真菌所產(chǎn)生的孢子隨空氣飄蕩，若不慎落入培養(yǎng)基中，一粒孢子足以污染整個(gè)培養(yǎng)基。酵母菌屬外界污染，菌落多為乳白色，少數(shù)為紅色，個(gè)別為黑色主要來源于工作人員。若在培養(yǎng)基中出現(xiàn)了真菌，可以利用顯微鏡進(jìn)行檢測，觀察孢子的形態(tài)，有無細(xì)胞壁的形成。一些情況下，真菌污染也可以用DNA探針做鑒定。詳見圖23.2病毒病毒是一種只含有DNA或RNA的遺傳印子，有很強(qiáng)的寄生能力，病毒顆粒特別微小（以納米為測量單位）所以病毒污染的概率比較

11、小。病毒污染難于發(fā)現(xiàn)，要用電子顯微鏡才可以觀察到，所以在工廠化生產(chǎn)挑污染的時(shí)候，不僅投入了大量的精力、物力、財(cái)力，而且還過于麻煩。由于病毒一般潛伏在細(xì)胞體內(nèi)，不會導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)死亡。一般用莖尖分生組織培養(yǎng)來進(jìn)行脫毒，當(dāng)然我們在實(shí)驗(yàn)室也可用根尖分生組織的。病毒類污染的鑒定是利用DNA有同源性而做探針偵測4。3.3細(xì)菌圖3.細(xì)菌污染圖（引自百度圖片）在我們生存環(huán)境的四周，細(xì)菌是所有生物中數(shù)量最多的一類，包括我們?nèi)祟愖陨?。它無孔不入，泥土里、水里、空氣里都有散布，或者和其他生物共生，形狀不同，大小不一。細(xì)菌污染的特點(diǎn)為在培養(yǎng)基表面或材料表面出現(xiàn)黏液狀、菌落或者是渾濁的水跡狀并伴有刺鼻氣味，有時(shí)甚至

12、出現(xiàn)泡沫發(fā)酵狀，一般在接種1-4天內(nèi)即能發(fā)現(xiàn)。它主要來源于接種工具（鑷子、剪刀）滅菌不徹底或是呼吸排出的細(xì)菌，有時(shí)由于接種人員的粗心大意，手接觸到了接種瓶的瓶口，致使微生物落入，也有時(shí)剪到了帶菌的植株又未發(fā)現(xiàn)，直接剪下一瓶植株而導(dǎo)致的。另外，培養(yǎng)室空間比較大、溫度又高、空氣濕度也比較高也會增加污染的概率。在接種過程中，可以利用生化反應(yīng)鑒定細(xì)菌類污染。詳見圖34 植物組培污染防治方法植物組培污染原因是多種多樣的，沒有固定的方法去整治植物組培污染菌。因此，防治組培苗污染也應(yīng)多方面考慮，只有確保每個(gè)環(huán)節(jié)的正確進(jìn)行，才能使工業(yè)化生產(chǎn)或者研究產(chǎn)生最小的成本5。4.1對接種人員的要求圖4. 某組培企業(yè)接種

13、人員管理制度 操作方面的污染首先要從工作人員的衛(wèi)生入手，操作人員應(yīng)及時(shí)剪除指甲、勤洗澡的良好衛(wèi)生習(xí)慣，進(jìn)入無菌區(qū)時(shí)不能佩戴戒指，不要吃東西，不能喝水以及禁止吸煙。工作服里外要分開，里面的只能在實(shí)驗(yàn)室穿，嚴(yán)禁外穿。在進(jìn)入無菌區(qū)前應(yīng)換好拖鞋，每天用消毒水拖地，工作服在休息的時(shí)候要清洗消毒，口罩、帽子要戴好，一次性用品及時(shí)更換，進(jìn)入無菌室前要用肥皂洗手，進(jìn)入培養(yǎng)室用75%的酒精對雙手進(jìn)行消毒。工作時(shí)禁止大聲講話，大幅度走動，以免帶動空氣中的孢子。詳見圖44.2對接種環(huán)境的要求接種室要保持干凈衛(wèi)生，應(yīng)每天打掃一遍。每天接種完畢后要用甲酚皂對工作臺及接種室消毒。定期檢查超凈工作臺污染情況，紫外燈損壞時(shí)要

14、及時(shí)更換，每次使用工作臺前，應(yīng)先用巴氏消毒水擦拭工作臺內(nèi)壁，然后用75%的酒精噴灑培養(yǎng)基和接種苗。打開工作臺的紫外燈照射20分鐘左右。接種室內(nèi)的空調(diào)應(yīng)定期清理，由于長時(shí)間使用空調(diào)而不經(jīng)常通風(fēng)，也可以會導(dǎo)致室內(nèi)真菌污染。有實(shí)驗(yàn)表明不定期清理接種室內(nèi)的空調(diào)比經(jīng)常清理空調(diào)會加重污染6 。4.3對器具的要求接種人員使用的鑷子、剪刀要嚴(yán)格按照滅菌標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行滅菌。每天應(yīng)將使用過的器具放入滅菌器內(nèi)滅菌，滅菌后浸泡于95%的酒精中，使用時(shí)應(yīng)在酒精燈火焰上灼燒三遍，灼燒一次應(yīng)沾一些酒精再次灼燒，直至灼燒三遍。每剪完一瓶或兩瓶母苗時(shí)要進(jìn)行灼燒。這樣就大大減少了器具帶菌的導(dǎo)致污染的概率。4.4對培養(yǎng)基的要求培養(yǎng)基是植

15、物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)。根據(jù)不同的培養(yǎng)物應(yīng)該配制不同的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基在配制時(shí)要配置準(zhǔn)確無誤，沒有滅菌的培養(yǎng)基里面有含有許多雜菌，若不慎接種后會很容易污染，從而加大了工廠化生產(chǎn)的成本，故培養(yǎng)基應(yīng)盡快在121、1.41Pa的高壓蒸汽滅菌鍋里面滅菌20-25分鐘，不可超過規(guī)定的壓力范圍,否則培養(yǎng)基中的蔗糖、有機(jī)物質(zhì)、維生素、激素等物質(zhì)就會分解,導(dǎo)致培養(yǎng)基變質(zhì)、變色,降低培養(yǎng)基的pH值,使培養(yǎng)基難以凝固 7 。降溫過程不要太過于急躁，切勿打開排氣閥直接進(jìn)行放氣處理，有研究通過對比一次和二次排空氣法對培養(yǎng)基的滅菌效果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過兩次排氣滅菌，沒有發(fā)生培養(yǎng)基滅菌不徹底現(xiàn)象，而使用一次排氣法進(jìn)行滅菌時(shí)，有時(shí)會發(fā)生因

16、無法排凈滅菌鍋內(nèi)空氣而使培養(yǎng)基滅菌不徹底8。4.5對培養(yǎng)瓶的要求培養(yǎng)瓶應(yīng)盡量選擇為廣口玻璃瓶，有利于在滅菌器具內(nèi)滅菌，滅菌后應(yīng)冷卻至室溫方可取出，以防炸裂傷害到工作人員。如果選擇的是專用的塑料瓶，應(yīng)仔細(xì)觀察該瓶可以接受的最高溫度及壓強(qiáng)，該培養(yǎng)瓶符合滅菌條件的可以直接滅菌，如若不符合，則用化學(xué)殺菌的方法來滅菌，這樣就彌補(bǔ)不能高壓滅菌的缺陷。4.6 對接種材料要求外植體的選擇是組培中的關(guān)鍵因素之一，因此取材應(yīng)以春夏生長旺季，最好是當(dāng)年生的嫩梢為佳，應(yīng)盡量選擇晴天，避免陰雨天氣，因中午有強(qiáng)烈的太陽光，陽光中的紫外線有利于殺菌，或者取離體枝梢在潔凈空氣條件下抽芽，然后從新生組織中取材接種。在選取時(shí)要注

17、意選擇再生能力比較強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定、滅菌容易的外植體。另外，胚也是一個(gè)很好的外植體材料，在接種材料不太好找的冬天，可以利用植物果實(shí)或種子中的胚獲得接種材料。4.6.1對外植體的消毒外植體大部分取自大自然，表面附著大量的微生物，在接種前必須將外植體所帶的菌殺滅，為了不影響其生長，又不能損傷外植體，所以外植體的消毒是植物組培工作中重要的環(huán)節(jié)。為達(dá)到最佳消毒效果,對于材料內(nèi)部帶菌的組織,有時(shí)還需在培養(yǎng)基中加入適量抗生素8 。 外植體消毒時(shí)切不可生搬硬套，要根據(jù)材料的大小、幼嫩程度、質(zhì)地等，選擇適宜的消毒劑種類、使用濃度和消毒時(shí)間，消毒的最佳效果以殺死材料上的所有微生物，而又對材料的損傷最小為好9。消毒果

18、實(shí)、種子之前應(yīng)先檢查一下表面有無破損處或者是為了保鮮而涂抹的蠟質(zhì)。如果無蠟質(zhì)直接可以用無菌水沖洗，若有蠟質(zhì)，則先用70%酒精浸泡2分鐘，然后放進(jìn)2%的次氯酸鈉溶液中浸泡。最后去除果皮，用內(nèi)生組織或種子接種即可。根和塊莖這兩種材料一般都常年生長在有大量微生物的土壤環(huán)境中，帶菌量比較多，故消毒應(yīng)謹(jǐn)慎徹底。先用小細(xì)毛（軟毛）刷子清洗表面，切不可用力和使用硬毛刷子，以防損傷表面。洗刷完畢后，用酒精溶液浸泡30秒，取出，再次浸泡于二氯化汞溶液中5分鐘，使用時(shí)用無菌水沖洗，然后用無菌紗布或者無菌紙吸干即可。葉片從樹枝上摘取后，先用水沖洗掉葉上面的灰塵或者是動物的糞便，然后用酒精浸泡約30s，在用二氯化汞浸

19、泡5分鐘然后用無菌水沖洗3次，消毒后的葉片在無菌的條件下既可以接種。4.6.2加入抗生素培養(yǎng)基中加入抗生素是為了防止內(nèi)生菌造成的污染，提高培養(yǎng)成功的概率。在組培中，常常因?yàn)槲廴径鴣G棄成百上千的污染物，采用適當(dāng)?shù)目股乜梢怨?jié)省大量的的財(cái)力、物力、人力以及時(shí)間。常用的抗生素有鏈霉素、青霉素、慶大霉素、四環(huán)素、氯霉素、卡那霉素等，用量一般為5-20mg/L9。在使用抗生素時(shí)要明確抑制病菌的種類，使用的抗生素是否對培養(yǎng)的植物組織有不良影響以及抗生素的使用濃度和處理時(shí)間。高濃度的抗菌素會傷害植物材料，引起對生長的抑制或畸變。而且抗生素通常只能抑制細(xì)菌生長而不能完全殺滅細(xì)菌。需要引起重視的是，抗生素有可能

20、會引起微生物產(chǎn)生抗性突變體，使?jié)摲奈廴緦χ参镆院蟮纳L造成影響10。要值得提醒的是，不要以為有了抗生素這一試劑，而放松或放棄滅菌的想法，此外，抗生素要有選擇的使用，不可盲目使用，否則容易導(dǎo)致植物不太適應(yīng)而停止生長。4.6.3操作間的消毒長期未使用的操作間，使用前應(yīng)先打掃干凈，然后關(guān)閉室內(nèi)窗戶，按其甲醛和高錳酸鉀的比例配制消毒水，然后使用電爐慢慢加熱，不可直接升至高溫。消毒后，緊閉室內(nèi)門窗1周即可使用。或者利用甲酚皂溶液和高錳酸鉀進(jìn)行室內(nèi)徹底消毒，及時(shí)清理污染材料，污染過的培養(yǎng)瓶應(yīng)在高壓滅菌器里面滅菌后方可使用。5結(jié)束語植物組織培養(yǎng)目前所面臨的問題是組培苗的污染，也是當(dāng)今組培行業(yè)的一大難題，而污染又是多種多樣的，研究者們一直在努力解決污染的課題。不同植物污染不同，只有在組織培養(yǎng)過程中高度重視，嚴(yán)格管理控制好每個(gè)環(huán)節(jié)的污染問題，才能降低污染率。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展和進(jìn)步，將會出現(xiàn)更高效、節(jié)能的新設(shè)備、新技術(shù)、新方法應(yīng)用于組織培養(yǎng)技術(shù)，從而有效的控制污染的發(fā)生，研究生產(chǎn)出更多更好的植物。參考文獻(xiàn)1 鞏振輝，申書.植物組織培養(yǎng)第二版M.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2013.2 謝鳳琦，張金蓮，董新玉.植物組織培養(yǎng)中常見病原菌種類及污染控制措施J.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2014(2):182-183. 3 屈云慧,楊春梅,蔣亞蓮.花卉組織培養(yǎng)中污染的發(fā)生與防治J.北方園藝，2007(8): 188